空心纳米针-石墨烯复合材料传感器及其应用的制作方法

本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种空心纳米针-石墨烯复合材料传感器及其在检测细胞内物质方面的应用。

背景技术

从环境安全监测到人类疾病诊断与治疗，生物检测技术已广阔应用于人类生活。尤其是人类疾病诊断领域，主要包括：人类基因检测，疾病检测与治疗以及药物传输等。其中，疾病检测中细胞层次检测为科学研究者的关注点，因此，如何实时准确的检测细胞内物质成为目前科学研究待解决的问题。

复合材料综合了各组成材料的优势，弥补了单个材料的不足，大大拓宽了复合材料的应用领域，成为科研领域新的热点。尤其是对纳米复合材料的研究，更是从纳米结构上大大提高了纳米复合材料各项性能，广泛应用于生物、材料、物理、化学等各个研究领域。其中，纳米复合材料在生物检测中的应用，利用了纳米复合材料优异的灵敏性、良好的重复性、环境友好性等优势，使生物检测更加便捷化、安全化、人性化，进而简化并增加了生物检测的途径方法。其中，复合材料电极用于检测细胞内物质，由于其检测方式简便、迅速、重复性高，成为了很多科学研究者优选方式。

但大多纳米复合材料只能监测细胞分泌出来的分子，或者被消化的细胞提取液，并不能检测活细胞内的生物分子。因此，如何利用纳米复合材料实时检测细胞内物质，同时不损伤细胞成为现在科研热点。

目前，细胞内检测多为将细胞溶解掉，提取溶解后的细胞液，检测细胞液内目标物质；或在细胞培养液内加入某种促分泌物质以促使培养细胞分泌目标物质，从而完成细胞外检测。细胞检测途径包括：电化学检测，荧光检测，拉曼检测等。以上检测方式多为一次性检测，且存在损坏细胞，检测精度等不足，难以做到在不破坏细胞正常生理功能和活性前提上，原位检测细胞内物质，还缺乏一种能够无创地提取细胞内物质，且能实现原位进行鉴定与分析的一体式装置。

空心纳米针可以研究许多生物系统的功能，从细胞、生物体液、到组织和生物体。目前，空心纳米针主要应用于细胞内药物释放以及细胞内物质提取与传输。与传统的探针相比，空心纳米针应用于细胞具有更低的毒性和干扰，可以非常有效地感知细胞内的环境。因此，可以与细胞进行长期、可逆相互作用：除了细胞内检测dna、rna、蛋白分子及其他生物分子，还可以对细胞定性诊断以及通过空心纳米针向细胞内传递药物等。且空心纳米针为纳米级尺寸，便于组装成大规模、有序阵列，进而监测大细胞群的生物功能。

石墨烯具有非常好的生物相容性，一直以来，石墨烯基纳米复合材料在医学领域(如：在生物检测、基因/药物传输、生物成像、靶向药物治疗、生物传感以及癌症治疗等)的应用引起了巨大关注。

技术实现要素：

本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种具有良好的生物相容性、灵敏度高、能够有效检测活细胞内的生物分子的空心纳米针-石墨烯复合材料传感器。

本发明的又一个目的是提供一种能够有效检测活细胞内的生物分子的方法。

为了实现以上发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种空心纳米针-石墨烯复合材料传感器，其包括：聚碳酸酯膜、位于所述聚碳酸酯膜一面的空心纳米针、以及位于所述聚碳酸酯膜另一面的杂化石墨烯复合电极。

优选地，所述聚碳酸酯膜具有均匀纳米孔径。更优选地，所述孔径大小为

优选地，所述空心纳米针为氧化铝空心纳米针。

本发明还提供了制备所述空心纳米针-石墨烯复合材料传感器的方法，其包括以下步骤：

(1)利用原子层沉积法与等离子体刻蚀法结合制备一面为氧化铝空心纳米针的聚碳酸酯膜；

(2)在聚碳酸酯膜的另一面制备杂化石墨烯复合电极。

本发明还提供了所述空心纳米针-石墨烯复合材料传感器在检测细胞中的生物分子方面的应用。

本发明还提供了一种利用所述空心纳米针-石墨烯复合材料传感器检测细胞内生物分子的方法，其包括以下步骤：利用外加压协助空心纳米针刺破细胞膜，细胞内的生物分子通过空心纳米针管道扩散渗透，在纳米针背面的杂化石墨烯复合电极检测，从而实现检测细胞中的生物分子。

根据上述利用所述空心纳米针-石墨烯复合材料传感器检测细胞内生物分子的方法，其进一步包括以下步骤：

将所述空心纳米针-杂化石墨烯复合电极固定在用聚二甲基硅氧烷制备的微流控器件底部，然后固定在氧化铟锡玻璃上，在所述微流控器件内部培养待检测细胞1-2天；在所述氧化铟锡玻璃与所述细胞之间加上定电位，实现所述细胞电穿孔，从而获得细胞内物质，细胞膜电击穿后，所述细胞内物质通过所述空心纳米针流出，到达位于所述聚碳酸酯膜另一面的所述杂化石墨烯复合电极，从而实现细胞内生物分子的检测。

本发明探索原子层沉积以及等离子体刻蚀等微纳加工条件，制备空心纳米针。空心纳米针尺寸与生物分子的提取效率以及细胞膜被刺穿后细胞的活性相关。可优化空心纳米针尺寸，从而达到既可以使生物分子具有足够扩散性，又不会对细胞造成损伤的目的。施加电压大小、时间长短为纳米针插穿细胞膜并保持细胞活性的关键因素。通过优化电压条件，可以使细胞膜长时间处于被空心纳米针头刺破状态，实现在对细胞内生物分子的足量提取的前提下，保持细胞活性和正常功能，从而实现后面几天内在不同时间点对相同细胞进行生物分子的提取与检测。氧化铝空心纳米针具有良好的生物相容性，适合应用于面向细胞的药物释放或生物检测应用。

本发明具有多种优势。首先，本发明构建的空心纳米针-杂化石墨烯复合电极用于检测细胞内生物分子，杂化石墨烯复合电极纳米材料的组成具有多样化，通过优化石墨烯基纳米材料组成，可以构建检测细胞内不同生物分子的传感器件；通过优化石墨烯基纳米材料结构，构建灵敏度更高的生物分子传感器。进而构建可同时检测单个细胞内多种生物分子的复合电极，实现对细胞内多种生物分子的实时监测，以及不同细胞不同生物分子的反复提取检测。其次，本发明中对于细胞内生物分子的检测方法为电化学检测，在检测方法研究中可以结合其他方式如拉曼检测、荧光检测等以实现细胞内生物分子的实时、多方式检测。

本发明的技术效果：①本发明采用空心纳米针与外加电压结合方式穿刺细胞膜，提取并检测细胞内生物分子，为微创式提取与检测细胞内生物分子提供了新思路；②本发明采用相反路径，将细胞内的生物分子通过空心纳米针引流到细胞外部的电极表面，为空心纳米针的进一步应用提供了新方向；③本发明利用空心纳米针-电穿孔技术，在不同时间点对细胞内生物分子进行提取检测，可实现大批量细胞的同时检测，此项技术有望为生物电子与生物信息研究领域增添理论及技术基础。④本发明对不同个体细胞内的生物分子进行区分检测，探索其对个体细胞的分析结果的分辨性。并探索不同时间点，对相同细胞进行生物分子提取检测，以实时掌握细胞内动态变化。

附图说明

图1是利用根据本发明的空心纳米针-石墨烯复合材料制成的电极实时检测细胞内生物分子的示意图。

图2是根据本发明的空心纳米针的sem表征图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。为简便起见，以下实施例中的部分步骤或操作参数未能一一尽述，但其在本领域技术人员所知晓的范围内。

实施例1：

制备氧化铝管状空心纳米针：使用具有均匀纳米孔径(优选孔径是400nm)的聚碳酸酯(pc)多孔膜为模板制备空心纳米针阵列。

首先，使用ald(原子层沉积)技术，在模板基体的所有表面包含内孔壁沉积上均匀的氧化铝层：用气相的三甲基铝[al(ch3)3]作为前驱体与水蒸汽脉冲交替地通入反应器，沉积氧化铝al2o3薄膜：①裸露在水蒸气中的聚碳酸酯多孔膜表面形成单分子层的羟基(-oh)原子团；②羟基原子团与al源分子反应，使得al源分子失去一个甲基原子团，并且形成化学键[al(ch3)2-o-c]；③下一个通入水蒸气的周期，水蒸气与剩余甲基完成配体反应，生成甲烷ch4和al2o3。整个ald过程进行400个周期，获得约30～40nm厚的al2o3膜。

然后，利用等离子体刻蚀法，用sf6和cf4气体刻蚀5min，将上表面的剩余氧化铝刻蚀掉。

接着，进一步利用o2等离子体刻蚀将部分的衬底膜刻蚀掉，形成氧化铝管状纳米针头结构。

空心纳米针的直径大小是由所选用的径迹蚀刻膜的孔径大小决定的，在本发明中，优选孔径是400nm的聚碳酸酯膜；而纳米针的长度是由o2等离子体刻蚀的时间长短决定的，在本发明中，优选o2等离子体刻蚀时间是20min，获得长度在约1μm的空心纳米针。

空心纳米针的结构使用扫描电镜进行表征。如图2所示。

实施例2：

将实施例1制备的氧化铝空心纳米针阵列衬底背面涂上一层浓度为1mol/l的cuso4溶液，快速烘干后，采用同样的方式，在涂覆cuso4溶液并烘干后的衬底上继续涂上一层低浓度氧化石墨烯水溶液(1.25mg/ml)，迅速干燥。重复以上步骤一次，即可得到具有多孔结构的空心纳米针-杂化石墨烯复合电极。

实施例3：

将实施例2制备的空心纳米针-杂化石墨烯复合电极与细胞穿刺器件整合。

使用聚二甲基硅氧烷(简称pdms)制备中间有孔的细胞培养容器(直径约5毫米)。随后将空心纳米针-杂化石墨烯复合电极水平置于pdms中间孔部底端，微针一侧朝上，杂化石墨烯复合电极一侧固定在氧化铟锡(简称ito)玻璃上。ito玻璃作为电极负极。pdms空洞内培养细胞4，细胞培养液上置一铂电极2，导电线路连接外部电源及函数发生器。pdms模块-空心纳米针衬底，以及杂化石墨烯复合电极-ito玻璃均使用未固化的pdms胶粘合。

实施例4：

如图1所示，为制备的空心纳米针-杂化石墨烯复合电极与细胞穿刺器件整合检测细胞内物质的示意图。其中，1为ag/agcl参比电极，2为铂电极，3为石墨烯电极，4为待检测的细胞，5为细胞内蛋白质分子，6为空心纳米针，7为聚碳酸酯多孔膜，8为pdms培养孔。

细胞培养与纳米针刺穿细胞膜：本发明选择贴壁细胞hela细胞系作为模型细胞用于基础实验(也可以扩展用于其他类型细胞)。在直径约0.5mm的培养孔底部铺放ito玻璃作为负极，连接至电化学工作站9。ag/agcl参比电极1、铂电极2也分别连接至电化学工作站9。pdms培养孔8-空心纳米针-杂化石墨烯复合电极-ito玻璃器件在培养细胞4前，进行灭菌处理，然后，在pdms培养孔8的内部涂覆多聚赖氨酸以增加细胞4粘附，培养24小时后，细胞4贴壁铺展生长并包裹空心纳米针6。通过函数发生器调整电脉冲参数(脉冲电压、脉冲时长、脉冲间隔、脉冲次数)，在ito玻璃与细胞4之间施加电压，直至细胞膜被空心纳米针6刺破，释放出细胞内蛋白质分子5。细胞膜穿孔情况研究，可通过空心纳米针6输送难于透过细胞膜的荧光分子(如碘化吡啶)到细胞内判定。而细胞4的存活，则可通过活细胞/死细胞双色染试剂判定。

本发明使用具有均匀纳米孔径的聚碳酸酯衬底膜(径迹蚀刻膜)作为模板，空心纳米针-杂化石墨烯复合电极为工作电极，银/氯化银电极为参比电极，铂电极为对电极，从而组成三电极系统，采用电化学方法，对空心纳米针-杂化石墨烯复合电极的性能进行分析。

本发明构建的空心纳米针-杂化石墨烯复合电极利用外加压协助空心纳米针刺破细胞膜，细胞刺破后，对细胞在不同时间段活性和功能进行研究，从而优化空心纳米针尺寸和外加电压，达到细胞长时间处于穿破状态，同时保持细胞活性的目的。细胞内的生物分子通过空心纳米针管道扩散渗透，在纳米针背面的杂化石墨烯复合电极检测，从而实现不同细胞生物分子反复提取检测，以及不同时间点，对同一个细胞进行反复的生物分子提取，检测细胞内生物分子的动态变化。

实施例5：

对于细胞膜穿孔后的自我修复情况的探究：在撤去电压后5-10分钟，输送碘化吡啶荧光分子。如果细胞内存在碘化吡啶红色荧光，则细胞膜仍处于保持破裂状态。调节脉冲间隔，使细胞膜在临近愈点再次被电压击穿，可使细胞膜保持相对较长时间的破裂状态，从而使细胞内更多的生物分子扩散进空心纳米针，到达杂化石墨烯复合电极。

实施例6：

细胞内生物分子的检测：

本发明利用外加脉冲电压协助空心纳米针刺破细胞膜，细胞内生物分子通过空心纳米针到衬底背面的杂化石墨烯复合电极。以空心纳米针-杂化石墨烯复合电极为工作电极，银/氯化银电极为参比电极，铂电极为对电极，从而组成三电极系统，采用电化学方法，对空心纳米针-杂化石墨烯复合电极的性能进行分析。

实验结果证明：细胞内存在碘化吡啶红色荧光，细胞内的生物分子扩散进空心纳米针，到达杂化石墨烯复合电极，空心纳米针-杂化石墨烯复合电极可以选择性检测溶液中生物分子，且具有良好的灵敏性与重复性。

实施例7：

细胞微创性研究：在细胞电穿孔后两天，检查细胞活性。

检测结果表明，细胞电穿孔后，仍保持了良好的细胞活性，不会损害细胞的正常生长。