本发明涉及紫外-可见光谱检测技术，尤其涉及一种针对牛乳中大肠杆菌总数的检测方法。
背景技术
大肠杆菌是牛乳中检出率最高的食源性致病菌，是国际公认的卫生监测指示菌，因此更加敏感的捕获大肠杆菌的特异性，实现其高效快速检测对保障我国乳制品安全具有重要意义。目前，牛乳中大肠杆菌的检测和计数主要依靠常规的细菌学培养法：多管发酵法和平板计数法，但此类方法耗时费力，操作专业性强，且无法满足快速、无损检测的需求。
紫外-可见吸收光谱常用于含有共轭体系的蛋白质等生物大分子的分析和研究，通过共轭结构的光谱特征可以反演出细菌微生物的成分组成、浓度等信息。此技术具有无需添加反应试剂、无损伤、操作简便等优点，已被广泛地应用于微生物定量检测中，目前国内外已经有多位学者利用此技术实现对。但有关牛乳中大肠杆菌的光谱特征及其总数的定量检测研究在国内还属空白。
其主要原因是牛乳所含成分复杂，且牛乳中的蛋白质、脂肪等生物大分子颗粒的粒径分布不均会产生光散射等因素引起的噪声干扰，还会大肠杆菌的检测光谱带来特征光谱红移、特征波长难以拾取、定量检测结果不准确等影响。
技术实现要素：
在下文中给出了本发明的简要概述，以便提供关于本发明的有些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本发明的穷举性概述。他并不是意图确定本发明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
鉴于此，本发明提供了一种针对牛乳中大肠杆菌总数的检测方法，以解决现有的由于牛乳成分复杂以及牛乳中蛋白质、脂肪等生物大分子产生光散射等因素引起的检测结果不准确的问题。
本发明提供了一种用于基于紫外-可见光谱技术的针对牛乳中大肠杆菌总数的检测方法，整体实验流程包括：将大肠杆菌菌粉进行活化与传代培养，获得具有生长活性的第三代大肠杆菌菌株；在无菌环境下将菌株移种到无菌全脂鲜牛乳中，分装后分别连续培养；将培养好的带菌牛乳放入比色皿中，利用紫外分光光度计获取其200~400nm的紫外-可见吸收光谱；与此同时，将12组培养时间的带菌牛乳进行平板计数，作为定标实验，并获取牛乳中大肠杆菌的数量的真实值；将获取的牛乳中大肠杆菌的紫外-可见吸收光谱导入数据处理软件进行合理的光谱数据处理，并利用紫外-可见吸收光谱对有机化合物中的共轭结构具有更高的敏感性的特点，从苯环共轭结构形成机理的角度来解释光谱特征波段红移现象，以此确定特征波段范围，建立回归预测模型，通过带菌牛乳的吸光度值与总数真实值相关性r与均方根误差值rmse来评价预测模型的稳定性和预测能力。
进一步地，所述大肠杆菌菌粉活化与传代培养步骤包括：菌种的活化：依据菌种活化说明，在无菌环境下，取适量菌粉于复溶液中，混合均匀后，将菌液划线接种入lb固体培养基中，倒置于37℃恒温培养箱中培养18h；菌体的分离：去除活化后的培养皿；挑取单个菌落于lb营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养18h；菌体的纯化：将得到的菌液进行离心-去离子水洗涤-吸弃上层清液-离心等重复以上步骤三次，为确保菌体不因高速旋转而受到破坏，离心机的速度设置为为3000r/min，并设定时间5min，以上得到大肠杆菌菌悬液。
进一步地，所述待测带菌牛乳样品的制备步骤包括：将300ml全脂献牛乳倒入锥形瓶中，并取无菌鲜牛乳25ml于试管中，编号为0，作为对照组：用移液器吸取200μl大肠杆菌菌悬液于牛乳中，混合摇匀后分装于11根试管中，每根25ml，分别编号1、2、3…11，为实验组；将实验组的样品放入恒温培养箱中，分别在37℃恒温条件下培养1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20h。
进一步地，所述牛乳中大肠杆菌的紫外-可见光谱的获取步骤包括：采用紫外分光光度计进行光谱数据的获取，依照牛乳成分的先验光谱信息，将光谱检测范围选定为200~400nm，同时为了避免遗漏有价值的特征信息，采样间隔设置为0.5nm，以去离子水作为参比：从培养好的带菌牛乳中移取5ml于比色皿中，每个时间点的样品重复测量三次，并取其均值作为测量结果。本文进行了4次独立完整的实验，共获取原始光谱数据144组，经过取均值及对有效光谱的初步筛选，得到可用于进一步预处理的光谱数据共36组，每组数据包含201个波长吸光度值。
进一步地，所述牛乳中大肠杆菌紫外-可见光谱特征波段选择的步骤包括：牛乳中大肠杆菌的紫外-可见吸收光谱在300~400nm波段连续出现特征波峰，波峰强度随时间增大且特征波段红移，根本原因是大肠杆菌含有的三种氨基酸分子中均存在苯环共轭结构，且氨基酸分子中苯环取代基存在-cooh与-nh2不同类对位取代、取代基内部结构复杂以及存在具有亲电取代活性的-oh、-nh2等取代基团通过共轭结构传递电子效应引起共轭双键数目增加等情况共同作用，促使共轭效应强度增大，特征波峰强度增大、吸收带红移，因此选择300~400nm波段作为光谱的特征波段。
进一步地，所述牛乳中大肠杆菌紫外-可见光谱数据预处理步骤包括：由于引起光谱特征难以提取的主要原因是牛乳中复杂的成分，以及脂肪、蛋白质等生物大分子粒径分布不均引起的光散射现象，因此选择能够有效地校正带菌牛乳光谱的散射现象的标准正态变量校正法（snv），消除或减弱光谱中的噪声干扰；并进一步使用s-g平滑卷积法消除基线漂移、倾斜等噪声，从而提高模型的稳健性和预测能力；针对上一步骤中特征波段的选择，对300~400nm的紫外-可见光谱数据信息采用连续投影法（spa）进行进一步的特征波长的拾取，拾取得到的特征波长的吸光度值，随时间吸光度的变化曲线均符合细菌的生长曲线，且在3h处均出现了“二次生长”这一规律性变化也完全符合细菌特有的生长规律，表明了spa算法所提取的特征波长是可以用来表征大肠杆菌生长特点的，进一步证明了snv-sg-spa对光谱预处理以及特征波长拾取的准确性。
针对类似牛乳的成分相对复杂的背景下微生物总数的检测，采用本发明的光谱检测方法，以及数据处理方法，能够充分考虑复杂环境对微生物检测光谱带来的光谱噪声干扰、特征红移等问题，从而可以得到更加准确的光谱定量检测结果。
本发明的用于基于紫外-可见光谱技术的复杂背景环境下微生物的总数检测方法以及针对复杂背景环境下光谱数据的预处理方法，利用snv-sg方法联合对原始光谱数据进行逐一校正、噪声平滑，spa算法进一步对预处理后的光谱中的特征波长进行提取，并利用微生物特有的“二次生长”的生长规律对特征波长进一步优选，能够有效地减小共线性影响，改善建模条件，提高所建立模型的预测能力和精度。
本发明以平板计数法作为实验结果的对照组，并利用能够代表大肠杆菌生长趋势的特征波长与平板计数法测得的大肠杆菌总数的真实值，构建了牛乳中大肠杆菌总数的pls预测模型。
附图说明
本发明可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而更好的理解，其中在所有附图中使用了相同或相似的附图标记来表示相同或者相似的部件。所述附图连同下面的详细说明仪器包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本发明的优选实施例和解释本发明的原理和优点。
在附图中：
图1为本发明实现复杂背景环境下，微生物检测光谱数据处理及回归预测模型建立的流程图；
图2为本发明中牛乳中大肠杆菌检测的原始光谱图；
图3为本发明中牛乳中大肠杆菌检测的特征波段光谱图；
图4为本发明中牛乳中大肠杆菌检测中snv-sg方法预处理后的光谱图；
图5为本发明中牛乳中大肠杆菌检测中spa算法优选的特征波在光谱中位置图；
图6为本发明中牛乳中大肠杆菌检测中特征波长处大肠杆菌生长曲线；
图7为本发明中牛乳中大肠杆菌检测中特征光谱与大肠杆菌总数建立的pls预测模型图；
本领域技术人员应当理解，附图仅仅是为了简答和清楚起见而示意性地示出的，而不用于对本发明的技术方案进行限制，以便有助于提高对本发明实施例的理解。
具体实施方式
在下文中结合附图对本发明做进一步说明。
本发明提供了一种用于基于紫外-可见光谱技术的针对牛乳中大肠杆菌总数的检测方法，整体实验流程包括：将大肠杆菌菌粉进行活化与传代培养，获得具有生长活性的第三代大肠杆菌菌株；在无菌环境下将菌株移种到无菌全脂鲜牛乳中，分装后分别连续培养；将培养好的带菌牛乳放入比色皿中，利用紫外分光光度计获取其200~400nm的紫外-可见吸收光谱；与此同时，将12组培养时间的带菌牛乳进行平板计数，作为定标实验，并获取牛乳中大肠杆菌的数量的真实值；将获取的牛乳中大肠杆菌的紫外-可见吸收光谱导入数据处理软件进行合理的光谱数据处理，并利用紫外-可见吸收光谱对有机化合物中的共轭结构具有更高的敏感性的特点，从苯环共轭结构形成机理的角度来解释光谱特征波段红移现象，以此确定特征波段范围，建立回归预测模型，通过带菌牛乳的吸光度值与总数真实值相关性r与均方根误差值rmse来评价预测模型的稳定性和预测能力。
下面结合图1来描述本发明的用于牛乳中大肠杆菌总数的紫外-可见光谱检测方法的详细的处理流程。
如图1所示，处理流程开始之后，执行步骤s110。
在步骤s110中，对微生物菌粉进行活化和传代培养，与牛乳混合配置待测菌悬液，在规定时间内连续培养。然后，执行步骤s120。
其中培养环境为无菌、37℃恒温下，连续培养1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20h。
在步骤s120中，利用紫外分光光度计获取不同培养时间的待测菌悬液的紫外-可见光谱。然后，执行步骤s130。
其中，紫外分光光度计的光谱检测范围选定为200~400nm，同时为了避免遗漏有价值的特征信息，采样间隔设置为0.5nm，以去离子水作为参比。
在步骤s130中，利用标准正态变量校正法（snv）结合s-g卷积平滑法消除或减弱噪声干扰。然后，执行步骤s140。
其中s-g卷积平滑法进行3次积分处理。
在步骤s140中，从苯环共轭结构形成机理的角度来解释光谱特征波段红移现象，以此确定特征波段范围300~400nm。然后，执行步骤s150。
其中，牛乳中大肠杆菌的紫外-可见吸收光谱在300~400nm波段连续出现特征波峰，波峰强度随时间增大且特征波段红移，根本原因是大肠杆菌含有的三种氨基酸分子中均存在苯环共轭结构，且氨基酸分子中苯环取代基存在-cooh与-nh2不同类对位取代、取代基内部结构复杂以及存在具有亲电取代活性的-oh、-nh2等取代基团通过共轭结构传递电子效应引起共轭双键数目增加等情况共同作用，促使共轭效应强度增大，特征波峰强度增大、吸收带红移，因此选择300~400nm波段作为光谱的特征波段
在步骤s150中，采用连续投影算法（spa）在特征波段内进行特征波长的拾取，根据微生物“二次生长”的生长规律对特征波长进行更加有效的筛选。然后。执行s160。
在步骤s160中，利用偏最小二乘法（pls）建立特征波长与微生物总数之间的模型关系，实现对复杂背景环境下微生物的总数进行定量分析。