微流控纸芯片阵列及其制备方法和应用与流程

本发明属于微流控芯片检测技术领域，具体涉及微流控纸芯片阵列及其制备方法和应用，尤其涉及一种基于微流控纸芯片阵列技术的肉品品质检测方法。

背景技术

肉类营养丰富，是居民膳食结构的重要组成部分，可以为机体提供蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养要素。肉类食品的蛋白质含量丰富，且均为优质蛋白，在人体内消化率高，容易被吸收利用，尤其是能够提供人体自身无法合成的八种必须氨基酸，弥补植物性氨基酸的缺陷。肉类中的脂肪不仅是人体能量的重要来源，也是脂溶性维生素的主要载体。肉类中所含维生素b1、b2和尼克酸以及铁、锌等矿物质对人们的身体健康起到重要作用。因此，肉类是人们日常饮食中不可或缺的一类食物。

随着社会经济的快速发展，国民生活水平不断提高，人们的饮食观念已发生巨大转变，对肉的需求不再只限于数量上的满足，而是更加关心肉品的内在品质与安全，如营养成分、新鲜程度以及毒害物质的含量等。近年来，食品安全问题频出，肉品品质及安全已经引起消费者、销售者、管理部门的极大关注。

通常情况下，判断肉品品质变化可以导致黏度、嫩度、风味、色泽、口感以及持水性等改变。表面发黏，颜色及气味变化等是肉品变质的主要标志。事实上，当肉品出现如上几种表观标志时，表明它的腐败程度已经极其严重。因此，通过感官特征评定肉品品质的方法不是一个十分合理有效的途径。

肉品变质是一个复杂的过程，包括ph改变、生物胺的增加等。生物胺是一类具有生物活性且天然存在的碱性含氮物质，普遍存在于动植物中，尤其是蛋白质含量丰富的肉品，无论是刚屠宰的生鲜肉还是经过低温存储一段时间的肉品，它们都含有多种生物胺类物质，且生物胺的含量与存储时间成正相关。

微流控纸芯片具有成本低、易加工、可携带、生物兼容性好以及试样消耗量少等优点，已作为一种新型的微流控分析技术平台，并用于临床诊断，食品质量控制和环境监测等领域。例如科技论文“微流控纸芯片的开发用于尿液总蛋白含量的快速检测”(期刊：现代盐化工，2018年2月，作者：李修平；任由；崔天宇等)，利用微控流纸芯片技术实现了尿液中总蛋白含量的快速检测。科技论文“微流控纸芯片用于茶多酚含量快速检测”(期刊：分析仪器，2016年，作者：郝振霞；金莉莉；周苏娟等)，采用由喷蜡打印法制备的微流控纸芯片技术检测了不同茶汤样品中的儿茶酚含量。纸芯片还具有分离作用，在亲水性的纸基通道中，疏水性物质流动性差，从而可以达到分离目的。将这一特性用于肉品检测过程中脂肪的分离，可以直到起高分析效果的目的。

技术实现要素：

发明目的：由于肉品成分复杂，单一检测某一理化性质难以准确评定肉品品质，本发明所要解决的技术问题是将多个不同检测指标的芯片组合成纸芯片阵列，实现肉品品质的多指标综合检测。

本发明还要解决的技术问题是提供了该微流控纸芯片阵列的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种肉品的检测方法，该方法基于微流控纸芯片阵列技术，检测肉品的多种理化性质，并进行综合评定。

技术方案：本发明提供了微流控纸芯片阵列，所述微流控纸芯片阵列包括多个独立的纸芯片组成纸芯处阵列，所述多个独立的纸芯片均包括单通道纸芯片制成的流动分离区、以及分别位于通道两端的圆形纸芯片制成的加样池和显色池，所述显色池分别通过不同的显色剂滴加后室温干燥获得，所述显色剂为甲基红、中性红、溴甲酚紫、卟啉锌和卟啉钴中的一种或几种。

其中，所述单通道纸芯片制成的流动分离区的材质为whatman1号纤维素层析纸制成，单通道长度为20～36mm，宽度为1～2mm，所述圆形纸芯片制成的加样池和显色池的半径均为2～5mm。

其中，所述甲基红、中性红、溴甲酚紫的浓度均为0.5～1.5mmol/l。

其中，所述卟啉锌和卟啉钴的的浓度均为3～5mmol/l。

其中，所述微流控纸芯片阵列包括5个独立的纸芯片组成微流控纸芯片阵列。

本发明内容还包括所述的微流控纸芯片阵列的制备方法，包括以下步骤：

1)使用软件设计多个如所述的纸芯片的外形，在whatman1号纤维素层析纸上打印外形轮廓，切出纸芯片；其中，使用autocad或word等软件设计并打印纸芯片，采用切割法裁剪；

2)显色剂的配制：配制不同浓度的甲基红、中性红、溴甲酚紫、卟啉锌或卟啉钴；

3)将配制好的显色剂分别滴加到步骤1)打印并切出的纸芯片上的显色池中，室温干燥即可获得纸芯片阵列。

其中，所述甲基红、中性红、溴甲酚紫的浓度均为0.5～1.5mmol/l，所述卟啉锌和卟啉钴的的浓度均为3～5mmol/l。

本发明内容还包括所述的微流控纸芯片阵列在肉品品质检测中的应用。

本发明内容还包括一种肉品品质检测方法，包括以下步骤：

1)配制第一类显色剂：以乙醇为溶剂分别制备甲基红、中性红和溴甲酚紫显色剂，分别在制备好的3个纸芯片的显色池滴加3～6μl，室温干燥；

2)配制第二类显色剂：以三氯甲烷为溶剂分别制备卟啉钴、卟啉锌溶液，分别在制备好的2个纸芯片的显色池滴加3～6μl，室温干燥；

3)分别称取2～5g不同储存时间的肉品样品，加2～5ml纯水研磨成匀浆，将匀浆分别在步骤1)和2)处理后的5个纸芯片的加样池中滴加30～60μl，液体从加样池顺着通道流向显色池，当液体进入显色池120～300s后，拍照，检测环境温度范围20～30℃；

4)将步骤3)拍照获得的图片转换成位图，分析检测前后显色池区域的各像素点r、g、b的变化值δr、δg、δb，最后分别得到显色池区域内所有像素的δr、δg、δb变化之和δtr、δtg、δtb，将这些不同储存时间下样品的δtr、δtg、δtb组成矩阵x，肉的新鲜程度为y，其中储存时间小于等于9h的定为新鲜(用[1,0,0]表示)，大于9且小于等于15h于定为不新鲜(用[0,1,0]表示)，大于15h定为腐败(用[0,0,1]表示)，由y组成矩阵y。

矩阵y为：

每一行为y；

矩阵x为：

，

c1,c2,…,c5分别表示显色剂1～5，s1,s2,…,sn分别表示样品1、样品2…，样品n；所述的像素点r、g、b分别指的是红色、绿色和蓝色。

采用偏最小二乘判别分析(plsda)方法建立基于矩阵x和矩阵y的方程(也可称模型)；

5)肉品新鲜度检测与评定:对于待检测肉，按步骤3)、4)方法获得δtr、δtg、δtb值，代入步骤4)所得的方程，即可得到肉品的新鲜度。

其中，所述肉品包括但不仅限于猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉等。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备如下优点：本方法充分利用纸芯片具有分离功能的特点，减少常规分析中的离心环节。本方法是多指标分析，克服单一指标检测不准确的缺点。检测灵敏度高，结果准确。检测过程无需应用高级的仪器设备，因而能满足多数人群应用，将促进更多“非专家”的普通群众的应用。

附图说明

图1微流控纸芯片的示意图；

图2以中性红为显色剂的检测池初始颜色(a)及加样后的颜色(b)变化图；

图3以溴甲酚紫为显色剂的检测池初始颜色颜色(a)及加样后的颜色(b)变化图；

图4以甲基红为显色剂的检测池初始颜色颜色(a)及加样后的颜色(b)变化图；

图5以卟啉钴为显色剂的检测池初始颜色颜色(a)及加样后的颜色(b)变化图；

图6以卟啉锌为显色剂的检测池初始颜色颜色(a)及加样后的颜色(b)变化图；

图7以甲基红为例，采用软件image-proplus6.0进行数据处理的示意图。

图8实施例5阵列式纸芯片的显色池区域内所有像素的δr、δg、δb值变化值之和δtr、δtg、δtb；中性红的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标1、2、3，甲基红δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标4、5、6，溴甲酚紫δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标7、8、9，卟啉钴的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标10、11、12，卟啉锌的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标13、14、15；

图9plsda模型进行“新鲜”样品预测的结果；

图10plsda模型进行“不新鲜”样品预测的结果；

图11plsda模型进行“腐败”样品预测的结果；

图12实施例6阵列式纸芯片的显色池区域内所有像素的δr、δg、δb值变化值之和δtr、δtg、δtb。

具体实施方式

下面结合实施实例详细说明本发明的技术方案，并不意味着对本发明的限制。

所有试剂均能在市面上购买得到，所有使用的试剂皆为分析纯。

本发明所述的卟啉锌为四苯基卟啉锌，其cas登记号为14074-80-7，卟啉钴为四苯基卟啉钴，其cas登记号为cas登记号14172-90-8。

实施例1微流控纸芯片阵列的制备

1)使用microsoftword2010软件设计纸芯片外形，流动通道总长度为36mm，宽度为2mm，通道两端的圆形纸芯片半径为2mm。在whatman1号纤维素层析纸上打印外形轮廓，切出纸芯片。如图1所示。纸芯片加工方便，外形完整，制备5个纸芯片组成微流控纸芯片阵列。

2)配制试剂：

0.001mol/l甲基红：称取甲基红0.014g于50ml烧杯中，加无水乙醇溶解，并用定容至50ml，备用；

0.001mol/l中性红：称取中性红0.014g于50ml烧杯中，加无水乙醇溶解，并用定容至50ml，备用；

0.001mol/l溴甲酚紫：称取溴甲酚紫0.027g于50ml烧杯中，加无水乙醇溶解，并用定容至50ml，备用；

0.004mol/l卟啉锌：称取卟啉锌0.135g于50ml烧杯中，加三氯甲烷溶解，并用定容至50ml，备用；

0.004mol/l卟啉钴：称取卟啉钴0.134g于50ml烧杯中，加三氯甲烷溶解，并用定容至50ml，备用。

将上述5种溶液分别滴加到5个纸芯片的显色池中，每种显色剂的滴加量分别为6μl，室温干燥，获得可用于检测应用的纸芯片阵列。

将纸芯片拍照并保存，在此之前取加样区进行白平衡校正。

实施例2微流控纸芯片阵列的制备

1)使用cad2008软件设计纸芯片外形，流动通道总长度为20mm，宽度为1mm，通道两端的圆形纸芯片半径为5mm。在whatman1号纤维素层析纸上打印外形轮廓，并切出纸芯片。纸芯片加工方便，外形完整，制备5个纸芯片组成微流控纸芯片阵列。

配制试剂：

0.001mol/l甲基红：称取甲基红0.014g于50ml烧杯中，加适量无水乙醇溶解，并用定容至50ml，备用；

0.001mol/l中性红：称取中性红0.014g于50ml烧杯中，加适量无水乙醇溶解，并用定容至50ml，备用；

0.001mol/l溴甲酚紫：称取溴甲酚紫0.027g于50ml烧杯中，加适量无水乙醇溶解，并用定容至50ml，备用；

0.004mol/l卟啉锌：称取卟啉锌0.135g于50ml烧杯中，加适量三氯甲烷溶解，并用定容至50ml，备用；

0.004mol/l卟啉钴：称取卟啉钴0.134g于50ml烧杯中，加适量三氯甲烷溶解，并用定容至50ml，备用。

将上述5种溶液分别滴加到5个纸芯片的显色池中，每种显色剂的滴加量分别为6μl，室温干燥，获得可用于检测应用的纸芯片阵列。

实施例3矩阵x的获得方法

取新鲜猪肉2g，加2ml纯水，研磨5min；研磨成匀浆。取实施例2方法制备的纸芯片阵列，用相机拍照，在拍照前进行白平衡校正。

将匀浆在加样池缓缓滴加60μl，液体从加样池顺着通道流向显色池，当液体进入显色池后300s，拍照。

将纸片照片采用软件image-proplus6.0处理，获得区域内的δtr、δtg、δtb值(如图7所示)。用未检测前的r、g、b值减去检测后的r、g、b值得到δr、δg、δb，最后得到显色池区域内所有像素的δr、δg、δb值变化值之和δtr、δtg、δtb即为矩阵x，结果如下：

中性红：δtr＝7975454.00，δtg＝3016426，δtb＝5618511

甲基红：δtr＝8949629，δtg＝7306528，δtb＝4927050

溴甲酚紫：δtr＝12542629，δtg＝8354822，δtb＝5027190

卟啉钴：δtr＝40000，δtg＝701000，δtb＝1134658

卟啉锌：δtr＝1070000，δt＝1015000，δtb＝916000

这些结果显示δtr、δtg、δtb变化明显，表明阵列式纸芯片可用于新鲜猪肉的检测。

实施例4矩阵x的获得方法

取腐败猪肉5g，加5ml纯水，研磨成匀浆，取实施例1方法制备的纸芯片阵列，用相机拍照，在拍照前进行白平衡校正。

将匀浆在加样池缓缓滴加20μl，液体从加样池顺着通道流向显色池，当液体进入显色池后180s，拍照。

将纸片照片采用软件image-proplus6.0处理，获得区域内的δtr、δtg、δtb值。用未检测前的r、g、b值减去检测后的r、g、b值得到δr、δg、δb，最后得到显色池区域内所有像素的得到δr、δg、δb值变化值之和δtr、δtg、δtb即为矩阵x。

中性红：δtr＝10424011，δtg＝5220761，δtb＝6618140

甲基红：δtr＝9242919，δtg＝7706477，δtb＝5366359

溴甲酚紫：δtr＝11629292，δtg＝7579867，δtb＝4593176

卟啉钴：δtr＝170000，δtg＝572000，δtb＝1052154

卟啉锌：δtr＝1181000，δt＝812000，δtb＝918000

这些结果显示δtr、δtg、δtb变化明显，表明阵列式纸芯片可用于腐败猪肉的检测。

实施例5猪肉肉品品质检测

取刚屠宰的猪肉30块，在15℃下保存，分别在保存3、9、15、18、24h取样。将这些不同时间下样品的δtr、δtg、δtb组成矩阵x，肉的新鲜程度为y，将储存时间小于等于9h的定为新鲜(用[1,0,0]表示)，大于9且小于等于15h于定为不新鲜(用[0,1,0]表示)，大于15h定为腐败(用[0,0,1]表示)。

猪肉样品经过上述处理后，新鲜的样品有60个，不新鲜的有30个，腐败的有60个。则矩阵y为：

第1～60行相同，第61～90行相同，第91～150行相同。

按实施例3方法获得各样品不同储存时间下纸芯片r、g、b变化值δr、δg、δb，这些样品经纸芯片检测，最后得到显色池区域内所有像素的得到δr、δg、δb值变化值之和δtr、δtg、δtb结果矩阵x。矩阵x如图8所示。其中，中性红的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标1、2、3，甲基红δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标4、5、6，溴甲酚紫δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标7、8、9，钴卟啉的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标10、11、12，锌卟啉的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标13、14、15；采用偏最小二乘判别分析(plsda)方法建立模型，对上述新鲜样品的预测结果如图9所示，错10个，正确率93.33％；对不新鲜样品的预测结果如图10，有10个预测错误，正确率93.33％；对腐败样品的预测结果如图11，有11个预测错误，正确率为92.6％。

根据上述3个模型中每个样品的预测概率结果，取最大者为最终结果。如73号样品的在“新鲜”、“不新鲜”和“腐败”的模型中计算结果分别是“新鲜”、“不新鲜”和“腐败”，相应的概率分别为0.62，0.93和0.89，则取概率为0.93的结果，即不新鲜。

取8块刚屠宰的猪肉，在15℃下保存，分别在保存3、9、15、18、24h取样。将这些不同时间下样品的δtr、δtg、δtb组成矩阵x，肉的新鲜程度为y，将储存时间小于等于9h的定为新鲜(用[1,0,0]表示)，大于9且小于等于15h于定为不新鲜(用[0,1,0]表示)，大于15h定为腐败(用[0,0,1]表示)，其中新鲜样品16个，8个不新鲜，16个腐败样品，用实施例3方法获得待测样品的纸芯片检测结果δtr、δtg、δtb，并用所建模型进行计算，新鲜、不新鲜和腐败的检测结果如下表，正确率为90.0％。

实施例6牛肉肉品的检测

取刚屠宰的牛肉15块，在20℃下保存，分别在保存1、6、9、12、15、18、24h取样，按实施例3方法获得各样品不同储存时间下纸芯片r、g、b变化值δtr、δtg、δtb。将这些不同时间下样品的δtr、δtg、δtb组成矩阵x，肉的新鲜程度为y，将储存时间小于等于9h的定为新鲜(用[1,0,0]表示)，大于9且小于等于15h于定为不新鲜(用[0,0,1]表示)，大于15h定为腐败(用[0,0,1]表示)。

牛肉样品经过上述处理，新鲜的样品有45个，不新鲜的有30个，腐败的有30个。则矩阵y为：

第1～45行相同，第46～75行相同，第76～105行相同。

经阵列式纸芯片检测，所得δtr、δtg、δtb，矩阵x如图12所示。其中，中性红的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标1、2、3，甲基红δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标4、5、6，溴甲酚紫δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标7、8、9，卟啉钴的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标10、11、12，卟啉锌的δtr、δtg、δtb分别对应于图中的横坐标13、14、15；采用偏最小二乘判别分析方法建立模型，正确率91.4％。

取7块刚屠宰的牛肉，在20℃下保存，分别在保存1、6、9、12、15、18、24h取样，按实施例3方法获得各样品不同储存时间下纸芯片r、g、b变化值之和δtr、δtg、δtb。将这些不同时间下样品的δtr、δtg、δtb组成矩阵x，肉的新鲜程度为y，将储存时间小于等于9h的定为新鲜(用[1,0,0]表示)，大于9且小于等于15h于定为不新鲜(用[0,0,1]表示)，大于15h定为腐败(用[0,0,1]表示)，其中新鲜样品21个，14个不新鲜，14个腐败样品。并用所建模型进行计算，所得结果正确率达91.8％。