基于双内标蛋白电泳滴定的乳品品质检测方法及检测装置与流程

本发明涉及分析化学技术、生物技术和转化医学等的技术领域，尤其是涉及一种基于双内标蛋白电泳滴定的乳品品质检测方法及检测装置。

背景技术：

乳制品的营养价值丰富，它含有多种蛋白质、氨基酸和维生素等人体所需的营养物质。乳品蛋白质含量是评价其质量的关键标准之一。已发展了一些蛋白检测方法，如凯氏定氮法、dumas法、双缩脲法、染料结合法等。但相关技术存在一些问题，如凯氏定氮法和dumas法存在非蛋白氮的干扰和检测时间长等问题；双缩脲法和染料结合法虽然不受非蛋白氮的干扰，但仍然存在检测时间长，样品消耗量大的问题。

为解决非蛋白氮干扰，基于移动反应界面(movingreactionboundary，mrb)概念发展了电泳滴定(electrophoresistitration，et)技术和装置(h.y.wang,c.y.guo,c.g.guo,l.y.fan,l.zhang,c.x.cao,anal.chim.acta,2013,774,92-99；h.y.wang,j.yang,j.y.dong,w.zhang,l.y.fan,w.b.zhang,c.x.cao,chinesej.anal.chem.,2012,40,968-972等)，申请了一下相关蛋白电泳滴定专利：

1、用于测定酸碱浓度的电迁移酸碱滴定装置，中国发明专利，2011年，申请号：cn201010596012.7；

2、一种用于测定蛋白质总浓度的可视化生物传感器装置，中国发明专利，2012年，申请号：cn201210142985.2；

3、基于移动反应界面电泳的高通量蛋白质滴定方法，中国发明专利，2013年，申请号：cn201310089084.6；

4、防渗漏电泳滴定电极液流动排气装置及其使用方法，中国发明专利，2014年，申请号：cn201410478864.4等。

et方法较好解决了非蛋白氮干扰问题，检测时间大为缩短。但也存在样品用量大、检测时间较长等问题。

为克服样品用量大、检测时间较长等问题，发展了蛋白电泳滴定芯片技术(h.y.wang,y.t.shi,j.yan,j.y.dong,s.li,h.xiao,h.y.xie,l.y.fan,c.x.cao,anal.chem.,2014,86,2888-2894；l.x.zhang,y.r.cao,h.xiao,x.p.liu,s.r.liu,q.h.meng,l.y.fan,c.x.cao,biosens.bioelectron.,2016,77,284-291)，并申请了一系列发明专利：

1、一种定性、定量一体化检测乳品掺次的方法，中国发明专利，2015年，申请号：cn201510542254.0；

2、定量测定乳品掺次程度的电泳滴定方法，中国发明专利，2015年，申请号：cn201510140100.9)。

芯片电泳滴定很好解决了样品用量大的问题，但是凝胶聚合仅单独采用化学法或紫外法，仍存在聚合时间长的问题，另外采用的是荧光指示剂来指示界面，需要辅助荧光检测设备，无法实现蛋白电泳滴定的微型化以及可视化现场检测，尤其是无法消除环境因素(如温度和读数早晚等)对检测结果的严重影响。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于双内标蛋白电泳滴定的乳品品质检测方法、装置及其检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种基于双内标蛋白电泳滴定的乳品品质检测方法，包括以下步骤：

1)设定检测上限内标蛋白和检测下限内标蛋白；

2)分别通过蛋白电泳滴定获取检测上限内标蛋白和检测下限内标蛋白对应的滴定点坐标u(cu,du)和l(cl,dl)；

3)根据滴定点坐标获取界面移动距离d与蛋白浓度c的线性关系；

4)根据待检测样品的滴定坐标t(ct,dt)定性获取待测样品质量并且定量获取待测乳品的蛋白含量。

所述的检测上限内标蛋白对应的蛋白浓度du为3.6mg/ml，即国际最高乳品标准，所述的检测下限内标蛋白对应的蛋白浓度dl为2.8mg/ml，即中国乳品蛋白标准。

所述的步骤3)中，界面移动距离d与蛋白浓度c的线性关系表达式为：

d＝-ac+b

其中，a、b为直线方程参数。

所述的步骤4)中，定性获取待测样品质量的判定方法为：

若dt>dl，则ct<cl，判定待测样品为低品质乳品；

若du≤dt≤dl，则cu≥ct≥cl，判定待测样品为合格乳品；

若dt<du，则ct>cu，判定待测样品为高品质乳品，其中，dt、ct分别为待测样品的界面移动距离以及对应的蛋白浓度。

所述的步骤4)中，定量获取待测乳品的蛋白含量的计算式为：

一种检测装置，该装置包括基座、上盖和分别设置在基座上一侧的电池、pcb板以及设置在基座另一侧的电泳室，所述的电泳室内从上至下依次内设有芯片压盖、电泳滴定芯片和led紫光灯，电泳室内室壁上设有电极接口，外室壁上设有led白光灯板，所述的led白光灯板和led紫光灯分别与pcb板连接，所述的芯片压盖翻盖式的扣设在电泳滴定芯片上。

所述的电泳滴定芯片包括上层芯片主体和底层胶膜，所述的上层芯片主体上设有通道u、通道t和通道l三个电泳通道以及对应的六个电极液池，所述的芯片压盖下表面设有数量和位置与电极液池匹配的金属电极，芯片压盖的外表面设有与电极接口匹配形成闭合电路的电极插头，用以为电泳滴定芯片的电泳滴定提供电场。

所述的电池为可充电锂电池，工作电压为12v，通过电池充电接口进行充电重复使用。

利用该装置实现电泳滴定检测的方法包括以下步骤：

1)配制加有指示剂的蛋白固定液分成共三份，第一份固定液中加入检测上限内标蛋白样品，混合均匀并注入通道u，设置为检测上限ul；第二份固定液中加入待检测样品，混合均匀并注入通道t；第三份固定液中加入检测下限内标蛋白样品，混合均匀并注入通道l，设置为检测下限ll；

2)将注入好固定液的电泳滴定芯片放置于电泳室，按下pcb板触摸屏上的凝胶按钮开始凝胶聚合，达到设置好的聚合时间后，在电泳滴定芯片两边的电极液池内加入等量的电极缓冲液，并将芯片压盖覆盖在电泳滴定芯片上使得电极插头与电极接口接触形成回路，待放置好电泳滴定芯片和芯片压盖后，启动电泳滴定；

3)待电泳自动停止后，记录三个通道的界面迁移距离du、dt和dl，并进行待检测样品蛋白含量的检测。

所述的指示剂为酚酞，所述的电极缓冲液离子强度低于0.1m/l，在电极液池内注入电极缓冲液为100μl，阴极液中oh^-离子占阴极液阴离子总浓度比例不高于20％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

一、检测方便：本发明提供的装置将检测和可视化判断融为一体，无需额外的检测设备，手机大小，能够手持检测，可以用肉眼做出定性判断和定量分析，使用方便。

二、缩短聚合时间：由于采用了化学和紫外相结合的方法进行凝胶聚合，大大缩短了聚合时间，本发明基于双内标蛋白电泳滴定技术的检测装置检测时间短(小于15分钟)。

三、抗环境因素干扰：双内标蛋白电泳滴定技术是抗干扰的技术，包括抗温度干扰、抗读取时间干扰和抗电压不稳干扰，具有良好的抗环境因素引起的系统误差。

四、可视化：本发明使用酚酞作为指示剂并结合双内标蛋白电泳滴定技术运用在电泳滴定芯片滴定中，实现了可视化判断测量结果，芯片通道的体积很小，所需的样品量消耗少并且芯片可以通过清洗重复使用。

附图说明

图1为双内标蛋白电泳滴定技术的原理示意图。

图2为蛋白电泳滴定芯片装配图

图3电泳滴定装置设计示意图。

图4为检测装置的整体示意图。

图5为检测装置的侧视图。

图中标记说明：

1、基座，2、电泳室，3、电泳滴定芯片，4、电子组件，5、电池，6、led白光灯板，7、led紫光灯，8、芯片压盖，9、电极接口，10、上盖。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以下发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细是实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明是通过以下方案实现的：

通过芯片电泳滴定可得蛋白浓度(c)与界面迁移距离(d)关系：

d＝-ac+b(1)

从方程(1)可以看出通过测量界面迁移距离(d)与蛋白浓度(c)存在线性关系。首先把高蛋白含量乳品设定为检测上限(ul)内标蛋白，低蛋白含量乳品设定为检测下限(ll)内标蛋白。然后ul和ll蛋白样品和待检样品通过芯片电泳滴定可得点u(cu,du)、l(cl,dl)和t(ct,dt)，点u和l把图像的d轴、c轴和方程线段分为低品质区(dt>dl)、合格品质区(du≤dt≤dl)和高品质区(dt<du)三段标尺。在图1中，ul和ll内标蛋白分别取自如国际最高乳品标准(新西兰乳品，3.6mg/ml)和我国乳品蛋白标准(2.8mg/ml)。因此利用图1和方程(1)双内标蛋白电泳滴定分析，可以定性判断待测样品质量：

①若dt>dl，则ct<cl，表示检测样品为低品质乳品；

②若du≤dt≤dl，则cu≥ct≥cl，表示检测样品为合格乳品；

③若dt<du，则ct>cu，表示检测样品为高品质乳品。

进一步的定量分析，将u(cu,du)、l(cl,dl)和t(ct,dt)分别代入方程(1)得：

du＝-acu+b(2)

dl＝-acl+b(3)

dt＝-act+b(4)

其中，通过芯片电泳滴定实验，(cu,du)、(cl,dl)和dt均已获得。而a和b可以通过方程(2)和(3)计算得：

这样，待检测样品的蛋白含量(ct)定量计算公式，可以通过方程(4)，(5)和(6)整理得：

因此，基于双内标蛋白电泳滴定技术、图1和方程(7)，还能够定量检测待测乳品的蛋白含量。

并且，双内标蛋白电泳滴定是抗环境因素干扰的技术，包括抗温度干扰、抗读取时间干扰和抗电压不稳干扰等导致的系统误差。在资源贫乏地区进行现场的食品安全检测、环境分析，存在许多干扰因素(如环境温度、读取时间等)。首先，10℃环境温度改变就将会导致15％-20％的离子迁移率的增减。一般情况下，环境温度是在10℃到40℃之间变化，这将导致45％-60％的离子迁移率偏差。从方程(1)、(7)和(8)可以看出，如果在不同的环境温度下利用标准曲线进行蛋白滴定，得到的结果会有很大的偏差。但是，如果采用双内标电泳滴定的方法，这些环境干扰将会被消除。其技术原理如下：

在蛋白电泳滴定中界面速度为：

在方程(8)中，和是蛋白质酸性氨基酸残基的浓度和迁移速度，coh和voh为阴极缓冲液池里oh^-的浓度和迁移速度。由于蛋白分子被固定在凝胶中，所以方程(8)可以重新写成：

方程(9)中，oh^-迁移速度为：

voh＝αm0,ohe(10)

在方程(10)中，α为温度校正系数，m0,oh为oh^-离子25℃下的迁移率，e为电场强度。

在给定的条件下，oh^-浓度是常量，酸性氨基酸残基的浓度虽是未知的但与蛋白质含量成正比。对于给定的测试样品，蛋白质含量c0是定值，可知与蛋白质含量成反比，即：

其中，β为校正系数。将方程(9)、(10)、(11)代入(1)得：

把ul内标样品、待测样品、ll内标样品代入方程(12)可得：

把方程(13)、(14)、(15)相比得：

方程(16)揭示界面迁移距离比只与样品浓度成反比，而与环境温度校正系数α无关；并且，与读取时间t的早晚无关，与使用电压的高低无关。因此，双内标蛋白电泳滴定是抗环境因素干扰的技术。

实施例：

本发明提出一种基于双内标蛋白电泳滴定的乳品品质检测方法，如图1所示，首先，把高蛋白含量乳品设定为检测上限(ul)内标蛋白，低蛋白含量乳品设定为检测下限(ll)内标蛋白。然后ul和ll内标样品和待检样品通过芯片电泳滴定可得点u(cu,du)、l(cl,dl)和t(ct,dt)，点u和l把图像的d轴、c轴和方程线段分为低品质区(dt>dl)、合格品质区(du≤dt≤dl)和高品质区(dt<du)三段标尺。在图1中，ul和ll内标蛋白分别取自如国际最高乳品标准(新西兰乳品，3.6mg/ml)和我国乳品蛋白标准(2.8mg/ml)。因此利用图1可以定性判断待测乳品质量：

1)若dt>dl，则ct<cl，表示检测样品为低品质乳品；

2)若du≤dt≤dl，则cu≥ct≥cl，表示检测样品为合格乳品；

3)若dt<du，则ct>cu，表示检测样品为高品质乳品。

如图2所示，为实现双内标蛋白电泳滴定，本发明提供一种手持式的双内标蛋白电泳滴定装置。图2是芯片的装配图，上层为芯片，下层为胶膜，电泳滴定芯片上有三个电泳通道分别为通道u、通道t和通道l，三个通道的两端为六个电极液池，可重复使用。图3是芯片电泳滴定装置示意图，主要包括：芯片、电极、led、pcb、触摸屏和锂电池。

本发明的双内标蛋白电泳滴定装置，其结构如图4所示，包括基座1、电泳室2、电泳滴定芯片3、电子组件4、电池5、led白光灯板6、led紫光灯7、芯片压盖8、电极接口9和上盖10。有如下布局：在基座1的一边设置有电泳室2，电泳室2中从下至上以此为led紫光灯7、电泳滴定芯片3和芯片压盖8，电泳室2的靠外两侧还分别设置有led白光灯板6、另一室壁上设置有电极接口9，基座1的另一边从下至上依次固定电池5和电子组件4。另外，如图5所示，电子组件还包括电路板4.1、触摸屏4.2、电池充电接口4.3和电源按钮4.4。触摸屏4.2中经软件编程设置有灯光控制按钮、参数设置按钮、凝胶控制按钮和电泳控制按钮。其中灯光控制按钮可以控制灯光为观测芯片电泳结果提供光源，参数设置按钮可以设定电泳时间和凝胶时间，凝胶控制按钮可控制开始和停止凝胶，电泳控制按钮可控制开始和停止电泳。电路板4.1控制整体装置的电路部分，是检测装置的控制中心。检测装置可通过电池充电接口4.3对装置中电池5进行充电，电池5为可充电锂电池，可充电锂电池电压为12v。电源按钮4.4是整个电路的总开关。芯片压盖8包括金属电极8.1以及与装置基座电源连接的电极插头8.2，可与电泳室2室壁上设置的电极接口9形成闭合电路为电泳滴定芯片3电泳滴定提供电场。最后用上盖10将上述部件封住。

本发明的双内标蛋白电泳滴定方法，包括以下步骤：

1)首先配制加有指示剂蛋白固定液分成三份，第一份固定液中加入ul内标蛋白样品，混合均匀并注入通道u，设置为检测上限；第二份固定液中加入待检测样品，混合均匀并注入通道t；第三份固定液中加入ll内标蛋白样品，混合均匀并注入通道l，设置为检测下限；

2)将注入好固定液的电泳滴定芯片放置于电泳室，按下电子组件中触摸屏上的凝胶按钮开始凝胶聚合。达到设置好的聚合时间后，在电泳滴定芯片两边的电极液池内加入等量的电极缓冲液。再将芯片压盖覆盖在电泳滴定芯片上将电极插头与电极接口连接，在放置好电泳滴定芯片和芯片压盖后，按下触摸屏上的开始按钮，启动电泳滴定；

3)待电泳自动停止后，记录三个通道的界面迁移距离du，dt和dl，根据图1和方程(7)可以分析乳品中蛋白含量。

本例中，采用的指示剂为酚酞，可以肉眼直接识别界面，解决了荧光指示剂需额外检测设备不易便携化的问题。电极缓冲液离子强度低于0.1m/l，在芯片电极液池内注入电极缓冲液约100μl，阴极液中oh^-离子占阴极液阴离子总浓度比例不高于20％。

本发明的具体实施例揭露如上，但本发明并不局限于上述。本发明所描述领域中的技术人员可以按照权利要求的范围内做出适当的修正和润饰，这并不影响本发明的实质。