双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法与流程

本发明涉及dna电化学传感器，具体涉及双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法。

背景技术：

真核细胞中的dna甲基化是指在甲基转移酶的催化条件下，cpg岛上的胞嘧啶分子5位碳原子上引入一个甲基的反应。作为一种最重要的表观遗传修饰，基因中cpg岛的异常甲基化状态是许多疾病的征兆，例如与癌症相关的dna高甲基化通常会控制肿瘤抑制基因的活性表达，与肿瘤细胞的形成和生长有关。因此，dna甲基化的有效检测对于癌症的早期诊断以及遗传信息控制的机理研究具有重要的意义。

作为一种有效的信号放大策略，超级三明治结构在生物传感器的构建领域逐渐受到重视。例如，yang等发展了一种新型的超级三明治结构，并将其应用于dna分析，当检测体系中有目标dna存在时，即使有一个目标dna，就可以作为“桥梁”，使带有大量信号物质的dna串联体与组装在电极表面的捕获探针相连，从而增强了电化学信号。[chem.commun.asimpleandultrasensitiveelectrochemicaldnabiosensorbasedondnaconcatamers.2011,47(44):12116-12118]。

由于仪器成本低、操作简单、灵敏性高、选择性好等优点，电化学方法被广泛用于基因组dna甲基化的分析。目前，dna甲基化的电化学检测均采用单信号输出，即一种目标物质对应输出单个电化学信号。单个信号响应的检测方法存在一定的局限性，容易受外界环境变化的干扰，例如ph、溶剂极性、温度、共反应剂等。同时，在复杂的生物基质中，一些假阳性或者假阴性的信号很难避免。所以，在dna甲基化分析中，双信号输出电化学传感器的构建是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种灵敏高并且快速方便的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法，包括步骤：

s1：在mos2纳米层表面原位合成aunps，形成aunps@mos2复合纳米材料；

s2：取aunps@mos2纳米复合材料滴涂到玻碳电极表面，干燥后得aunps@mos2纳米复合材料修饰的玻碳电极；

s3：将相同浓度的5′端修饰二茂铁的探针probe1-fc和3′端修饰亚甲基蓝的探针probe2-mb于水浴中反应，得到双信号串联体探针，其中，所述probe1-fc的序列为5′-fc-caatttccttccactcgtccggaggaaggtgccg-3′，所述probe2-mb的序列为5′-cgagtggaaggaaattgcggcaccttcctccgga-mb-3′；

s4：将步骤s2得到的电极浸泡在捕获探针capturedna的溶液中，过夜，其中capturedna的序列为5′-sh-ttttcatccaaatactccacacg-3′；

s5：将电极浸入含有待测甲基化基因的缓冲溶液中；

s6：将步骤s5中得到的电极浸入双信号串联体探针溶液中，得双信号超级三明治电化学传感器；

s7：将步骤s6得到的双信号超级三明治电化学传感器的工作电极、饱和甘汞电极和铂电极构成三电极体系，置于磷酸盐缓冲溶液和氮气氛围中进行检测。

优选的，所述步骤s1具体包括：在聚乙烯吡咯烷酮环境中，将氯金酸缓慢注入mos2纳米层悬浮液中，剧烈震荡几分钟，室温下反应得到酒红色aunps@mos2纳米复合材料。

优选的，所述步骤s2具体包括：取10launps@mos2纳米复合材料滴涂到玻碳电极表面并于室温下在空气中自然避光干燥，得到aunps@mos2纳米复合材料修饰的玻碳电极。

优选的，所述步骤s3具体包括：将相同浓度的5′端修饰二茂铁的探针1probe1-fc和3′端修饰亚甲基蓝的探针2probe2-mb于37℃水浴中反应2h，得到双信号串联体探针，probe1-fc的序列为5′-fc-caatttccttccactcgtccggaggaaggtgccg-3′，probe2-mb的序列为5′-cgagtggaaggaaattgcggcaccttcctccgga-mb-3′。

优选的，所述步骤s4具体包括：将s2得到的电极浸泡在捕获探针capturedna的溶液中，4℃过夜，capturedna的序列为5′-sh-ttttcatccaaatactccacacg-3′。

优选的，所述步骤s5具体包括：将电极浸入含有待测甲基化基因的缓冲溶液中，37℃反应1h。

优选的，所述步骤s6具体包括：将步骤s5中得到的电极浸入双信号串联体探针溶液中，37℃杂交反应2h。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法，利用复合纳米材料、双信号导出技术、超级三明治放大策略构建了灵敏高并且快速方便的电化学传感体系，不仅可以识别不同甲基化程度的肿瘤抑制基因，而且可应用于完全甲基化的肿瘤抑制基因的高灵敏检测，可以满足临床样品检测的灵敏性要求。

附图说明

图1是双信号超级三明治电化学传感器的构建示意图；

图2是mos2纳米层的扫描电镜图；

图3是aunps@mos2纳米复合物的扫描电镜图；

图4是p53肿瘤抑制基因甲基化状态的电化学识别图，其中曲线a是预处理的没发生甲基化的p53肿瘤抑制基因；曲线b是完全甲基化的p53肿瘤抑制基因；曲线c是顶端单甲基化的p53肿瘤抑制基因；曲线d是中间单甲基化的p53肿瘤抑制基因；

图5是电化学响应的双信号与不同浓度的完全甲基化的p53肿瘤抑制基因的关系图，其中，浓度从a到g依次为：10fm，100fm，1pm，10pm，100pm，500pm，1nm。

具体实施方式：

实施例

下面以p53肿瘤抑制基因为例对本发明做进一步的解释说明。

图1所示是双信号超级三明治电化学传感器的构建及其在完全甲基化的p53肿瘤抑制基因检测中的应用示意图。首先，aunps@mos2纳米复合物滴涂在玻碳电极表面，然后通过au-s键的作用将末端巯基修饰的capturedna直接固定到aunps表面，capturedna的序列为5′-sh-ttttcatccaaatactccacacg-3′(seqidno.1)。当目标物质存在时，3′端碱基片段(cgtgtggagtatttggatga)将会和capturedna杂交配对，目标物质被捕捉到电极表面。目标物质中未反应的剩余基因片段(cgagtggaaggaaattg)将会和双信号串联体探针中的probe1反应，电活性物质(fc和mb)组装到电极表面，从而实现双信号的电化学检测。

aunps@mos2纳米复合材料的制备方法包括以下步骤：

取0.3g二硫化钼粉末溶解于n-丁基锂溶液中，氮气氛围中搅拌反应48h。通过离心去除多余或未反应的溶剂后，无氧去离子水加入li插层的mos2沉淀物中，超声1h完成剥离过程。然后，通过离心分离收集产物，用水和酒精将产物洗涤数次，得到mos2纳米层。结果如图2所示，剥落的mos2纳米层具有明显的褶皱层状纳米结构。为了合成aunps@mos2纳米复合材料，将聚乙烯吡咯烷酮加入到mos2纳米层悬浮液中，剧烈震荡几分钟。随后，10mm氯金酸慢慢注入上述混合物中，室温下搅拌反应得到酒红色的aunps@mos2纳米复合材料。结果如图3所示，大量的粒径12nm左右的aunps均匀的原位生长在mos2纳米层的表面。

p53肿瘤抑制基因甲基化状态的电化学识别：为了验证构建的双信号超级三明治电化学传感器可以用来分辨p53肿瘤抑制基因的甲基化程度，将固定在aunps@mos2上的capturedna与预处理的不同甲基化程度的p53肿瘤抑制基因发生杂交反应，然后将杂交之后的产物置于双信号probe1-fc&probe2-mb串联体探针溶液中，结果如图4所示，probe1-fc的序列为5′-fc-caatttccttccactcgtccggaggaaggtgccg-3′(seqidno.2)，probe2-mb的序列为5′-cgagtggaaggaaattgcggcaccttcctccgga-mb-3′(seqidno.3)。在-0.28v位置处出现的信号峰归属于mb的还原，0.18v位置处出现的信号峰归属于fc的氧化。当capturedna与预处理的发生全甲基化的p53肿瘤抑制基因杂交后(曲线b)，fc和mb的氧化峰电流均明显强于未发生甲基化的p53肿瘤抑制基因(曲线a)和发生半甲基化的p53肿瘤抑制基因(曲线c和曲线d)。值得一提的是，中间部位发生甲基化的p53肿瘤抑制基因构建的传感器的峰电流强于顶端部位发生甲基化的p53肿瘤抑制基因构建的传感器。表明我们构建的双信号超级三明治电化学传感器可有效应用于p53肿瘤抑制基因甲基化状态的识别。

完全甲基化p53肿瘤抑制基因的高灵敏检测：利用此传感器检测完全甲基化p53肿瘤抑制基因的浓度。从图5中可知，随着完全甲基化p53肿瘤抑制基因浓度的增加，fc和mb的峰电流强度同时不断增加，且在10fm到1nm浓度范围内呈现良好的线性关系。检出限分别是450am和700am。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttttcatccaaatactccacacg23

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccaatttccttccactcgtccggaggaaggtgccg35

<210>3

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgagtggaaggaaattgcggcaccttcctccgga34