左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的检测方法、使用的电化学传感器以及手性吡咯化合物与流程

本发明提供一种右氧氟沙星含量的检测方法，特别是左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的电化学检测方法，在该电化学检测方法中使用的手性聚吡咯电化学传感器，以及提供一种手性吡咯化合物。
背景技术：
：手性(chirality)是指物体不能和其镜像重合的特性，具有这种特性的手性化合物称为一对对映异构体。手性在生命过程中发挥着独特的功能，在生物体系复杂的手性环境中，手性分子的精确识别可导致生物体产生不同的生理效应，手性药物就是最典型的例子。二十世纪五十年代震惊了全世界的“反应停”事件让人们至今心有余悸，之后的研究发现，消旋体“反应停”中，只有它的(r)-异构体有镇静作用，而它的(s)-异构体则是具有致畸作用的。2000年fda提出具有手性中心的药物必须以单一异构体形式上市。这样不仅疗效确切、副作用少且临床用量少。左氧氟沙星(其结构式如下)，商品名：可乐比妥；分子式：c18h20fn3o4；化学名称：(3s)-(-)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7h-吡啶并[1,2,3-de]-[1,4]苯并恶嗪-6-羧酸，是由日本第一制药厂开发的第三代喹诺酮类抗菌药。该药物由于3位碳原子连有四个不相同的基团而具有手性，其中，左氧氟沙星为氧氟沙星的光学活性(3s)-异构体，其抗菌活性为其(3r)-异构体(也称为右氧氟沙星或对映异构体，以下均称为右氧氟沙星)的8-128倍，为消旋体氧氟沙星的2倍，且毒副作用小。目前，关于左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量测定的方法主要为高效液相色谱法。但是，用高效液相色谱法检测手性药物的光学纯度，往往需要昂贵的手性色谱柱或添加了手性诱导剂的流动相，这样不仅检测成本高，操作繁琐，还会产生大量的流动相废液；另外，检测速度慢、检测时间长，检测限和灵敏度低也是高效液相色谱法的不足之处。技术实现要素：鉴于上述问题，本发明人研制了一种电化学检测左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的方法，以2,5-二甲氧基四氢呋喃和(r)-(+)-4-甲氧基-α-甲基苄胺为原料，制备得到新的手性吡咯化合物(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷；然后，以(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷为单体，通过电化学聚合法修饰到电极表面，得到手性聚吡咯电化学传感器；最后，利用该手性聚吡咯电化学传感器的手性识别功能，结合电化学循环伏安分析方法检测左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量。因此，本发明的目的在于提供一种手性吡咯化合物；本发明的另一目的在于提供一种手性聚吡咯电化学传感器；本发明的还一目的在于提供一种快速、操作简便、准确、灵敏的左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的电化学检测方法，该检测方法利用上述手性聚吡咯电化学传感器的手性识别功能，通过电化学方法，能够简便、准确地检测左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星的含量。根据本发明的一个方面，本发明提供一种新的手性吡咯化合物(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷，其结构式如下：所述手性吡咯化合物(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷制备方法如下：(r)-(+)-4-甲氧基-α-甲基苄胺和2,5-二甲氧基四氢呋喃反应，得到(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷，反应方程式如下：在酸催化下，2,5-二甲氧基四氢呋喃和(r)-(+)-4-甲氧基-α-甲基苄胺进行缩合反应，得到(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷。具体地，在反应中，2,5-二甲氧基四氢呋喃和(r)-(+)-4-甲氧基-α-甲基苄胺的摩尔比为5:1～1:1，且优选3:1～1:1；催化剂酸可以是稀硫酸、稀盐酸或者冰乙酸等，且优选冰乙酸；反应温度为50℃～100℃，且优选70℃～80℃；反应时间为1～4h，且优选2～2.5h。根据本发明的另一个方面，本发明提供一种手性聚吡咯电化学传感器，手性聚吡咯电化学传感器包括：玻碳电极，和修饰在玻碳电极上的聚[(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷]膜层。根据本发明的手性聚吡咯电化学传感器，按如下方法制备：采用电化学工作站，以玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl电极为参比电极；溶解了(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷、四丁基高氯酸铵和(d)-(+)-樟脑-10-磺酸的乙腈溶液为电解液；将上述三个电极插入到电解液中构成一室三电极体系；通过循环伏安法，(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷在玻碳电极表面聚合，得到聚[(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷]膜修饰的玻碳电极，即手性聚吡咯电化学传感器。更具体地，所述电化学工作站是由计算机控制的电化学分析仪，可以市购得到，例如苏州瑞思泰仪器有限公司的rst5000型电化学工作站。首先进行电极预处理，选取面积约为10～30mm2的玻碳电极，将玻碳电极用al2o3粉末(例如0.05μm的al2o3粉末)进行抛光，然后将玻碳电极、铂丝电极与ag/agcl电极用二次水超声清洗(例如超声清洗5分钟)，用乙醇超声清洗(例如超声清洗5分钟)，再用二次水超声清洗(例如超声清洗5分钟)。然后进行电解液配制，将(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷、四丁基高氯酸铵和(d)-(+)-樟脑-10-磺酸加入乙腈中，用超声波加速溶解，通氮气除氧，得到电解液，其中，(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷的浓度为0.05～0.2mol/l，优选0.09～0.12mol/l；四丁基高氯酸铵的浓度为0.05～0.2mol/l，优选0.09～0.12mol/l；(d)-(+)-樟脑-10-磺酸的浓度为0.05～0.2mol/l，优选0.09～0.12mol/l。将预处理过的玻碳电极、铂丝电极和ag/agcl电极插入到上述制备的电解液中构成一室三电极体系，优选在氮气气氛下利用循环伏安法进行电化学聚合，电位扫描范围为-0.2～2.0v，扫描速度0.05v/s，循环圈数为30～100圈，优选40～60圈，(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷在玻碳电极表面聚合，得到聚[(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷]膜修饰的玻碳电极，即手性聚吡咯电化学传感器。根据本发明的还一方面，提供一种左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的电化学检测方法。由于左氧氟沙星和右氧氟沙星具有不同的三维立体结构，而该手性聚吡咯电化学传感器具有三维立体结构识别功能，当左氧氟沙星和右氧氟沙星在包括手性聚吡咯电化学传感器的电化学体系中发生氧化还原反应时，各自的氧化峰分别出现在不同的电位处。然后可根据右氧氟沙星氧化峰电流数值，换算得到右氧氟沙星浓度。具体地，将上述制备得到的手性聚吡咯电化学传感器和ag/agcl参比电极插入到左氧氟沙星标准溶液中，饱和甘汞电极插入饱和氯化钾溶液中，在左氧氟沙星标准溶液和饱和氯化钾溶液间搭建盐桥，然后将电极连接到电化学工作站上，常温下采用循环伏安法进行检测，设置电位扫描范围为-0.2～2.4v，扫描速度为0.1v/s，循环圈数为1圈，测得左氧氟沙星在1.589v处有个氧化峰，其中左氧氟沙星标准溶液为左氧氟沙星标准品溶解于含四丁基高氯酸铵的乙腈溶液中而配制得到。采用上述同样的方法，测得右氧氟沙星在1.973v处有一个氧化峰。左氧氟沙星和右氧氟沙星的氧化峰出现在不同的电位处，即该手性聚吡咯电化学传感器可以识别左氧氟沙星和右氧氟沙星。本发明的左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的电化学检测方法，步骤如下：步骤1：绘制标准曲线并建立线性回归方程溶液配制空白对照溶液：在乙腈中加入四丁基高氯酸铵，制备成含四丁基高氯酸铵0.05～0.2mol/l的乙腈溶液；标准溶液：取上述空白对照溶液，向其中加入右氧氟沙星标准品，制得系列浓度的右氧氟沙星标准溶液(且优选浓度在1mmol/l～0.05mmol/l之间)；将上述制备得到的手性聚吡咯电化学传感器和ag/agcl参比电极插入到右氧氟沙星标准溶液中，饱和甘汞电极插入饱和氯化钾溶液中，在右氧氟沙星标准溶液和饱和氯化钾溶液间搭建盐桥，然后将电极连接到电化学工作站上，常温下采用循环伏安法进行检测，分别检测多个系列不同浓度的右氧氟沙星标准溶液，得各浓度右氧氟沙星标准溶液的氧化峰电流数值，根据峰电流数值及标准溶液的浓度绘制右氧氟沙星浓度-电流标准曲线，得到线性回归方程；步骤2：左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的电化学检测精密称取左氧氟沙星原料药，溶解于上述空白对照溶液中，配制成检测液，将上述制备的手性聚吡咯电化学传感器和ag/agcl参比电极插入到该检测液中，饱和甘汞电极插入饱和氯化钾溶液中，在检测液和饱和氯化钾溶液间搭建盐桥，然后将电极连接到电化学工作站上，常温下采用循环伏安法进行检测，记录右氧氟沙星氧化峰电流数值，带入上述回归方程，计算出该左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星的含量。在本发明检测方法中，常温下采用循环伏安法进行检测，具体地，设置电位扫描范围为-0.2～2.4v，扫描速度为0.1v/s，循环圈数为1圈。有益效果本发明的检测方法相对于现有技术的有益效果：相比常用的高效液相色谱法，电化学检测方法最大的优点在于仪器造价低、操作方便、检测速度快、灵敏度高，并且基本不排放废液。附图说明图1为实施例3中根据峰电流及标准溶液的浓度绘制右氧氟沙星浓度-电流标准曲线。具体实施方式下面，通过实施例更具体地说明本发明的手性吡咯化合物、手性聚吡咯电化学传感器的制备，以及左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的电化学检测方法，但本发明的保护范围不局限于这些实施例中。实施例1(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷的制备在100ml三颈瓶中加入20ml水、2.00g(0.024mol)乙酸钠在室温下溶解，搭好回流冷凝管及搅拌装置；再加入10ml(0.17mol)冰乙酸和1.208g(0.008mol)(r)-(+)-4-甲氧基-α-甲基苄胺，升温至75℃搅拌10min；将溶有1.5ml(0.012mol)2,5-二甲氧基四氢呋喃和0.5g(0.006mol)无水乙酸钠的水溶液滴加到反应液中，滴毕，保持在75℃下搅拌2h，停止反应；将反应液冷却至室温，用二氯甲烷萃取，取有机相，用水和饱和氯化钠溶液依次洗涤，加入无水硫酸镁干燥，该有机相进行硅胶柱层析纯化，洗脱液为乙酸乙酯：石油醚＝1:19(体积比)，得到目标产物(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷1.1078g，产率为68.89％。比旋光度：+4.1°；1h-nmr(dmso-d6，δppm)：1.811-1.828(d,3h,-ch3,j＝6.8hz)，3.795(s,3h,-och3)，5.221-5.274(q,1h,-ch-,j＝21.2hz)，6.190-6.194(t,2h,吡咯环氢,j＝1.6hz)，6.745-6.755(t,2h,吡咯环氢,j＝4.0hz)，6.844-6.866(dd,2h,苯环氢,j1＝2.0hz,j2＝2.0hz)，7.050-7.071(dd,2h,苯环氢,j1＝1.6hz,j2＝1.6hz)；13c-nmr(dmso-d6，δppm)：21.75，55.02，56.80，108.12，114.19，119.34，127.48，136.01，158.45；hrms：c13h15no[m+h]+计算值202.1264，测得值202.1257。实施例2手性聚吡咯电化学传感器的制备步骤1：电极预处理将玻碳电极用0.05μm的al2o3粉末进行抛光，将玻碳电极、铂丝电极与ag/agcl电极二次水超声清洗5分钟，再乙醇超声清洗5分钟，再二次水超声清洗5分钟。步骤2：制备手性聚吡咯电化学传感器取上述实施例1制备的(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷1.005g(0.005mol)、四丁基高氯酸铵1.709g(0.005mol)、(d)-(+)-樟脑-10-磺酸1.1615g(0.005mol)溶于50ml乙腈中，利用超声波加速溶解，通氮气除氧，得到电解液；采用电化学工作站，以玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述预处理过的三个电极插入上述电解液中，构成一室三电极体系，在常温下进行电化学聚合；采用循环伏安法，设置电位扫描范围为-0.2～2.0v，扫描速度为0.05v/s，循环圈数为50圈，得到致密的聚[(r)-(+)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(1-吡咯基)乙烷]膜修饰的玻碳电极，即该手性聚吡咯电化学传感器。实施例3左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的电化学检测1.溶液配制空白对照溶液：在乙腈中加入四丁基高氯酸铵，制备成含四丁基高氯酸铵0.1mol/l的乙腈溶液。标准溶液：取30ml上述空白对照溶液，向其中加入0.05mmol右氧氟沙星标准品，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得1mmol/l右氧氟沙星标准溶液；同法配制1mmol/l左氧氟沙星标准溶液；取30ml上述空白对照溶液，向其中加入0.025mmol右氧氟沙星标准品，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得0.5mmol/l右氧氟沙星标准溶液。取30ml上述空白对照溶液，向其中加入0.0125mmol右氧氟沙星标准品，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得0.25mmol/l右氧氟沙星标准溶液；取30ml上述空白对照溶液，向其中加入0.00625mmol右氧氟沙星标准品，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得0.125mmol/l标准溶液；取30ml上述空白对照溶液，向其中加入0.003125mmol右氧氟沙星标准品，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得0.0625mmol/l右氧氟沙星标准溶液。2.左氧氟沙星和右氧氟沙星氧化峰位置确定将实施例2中制备得到的手性聚吡咯电化学传感器和ag/agcl参比电极插入到1mmol/l左氧氟沙星标准溶液中，饱和甘汞电极插入饱和氯化钾溶液中，在左氧氟沙星标准溶液和饱和氯化钾溶液间搭建盐桥，然后将电极连接到电化学工作站上，常温下采用循环伏安法进行检测，设置电位扫描范围为-0.2～2.4v，扫描速度为0.1v/s，循环圈数为1圈，测得左氧氟沙星标准溶液在1.589v处有个氧化峰。采用上述同样的方法，测得右氧氟沙星在1.973v处有一个氧化峰。由此表明，该手性聚吡咯电化学传感器可以识别左氧氟沙星及其右氧氟沙星。3.绘制标准曲线并建立线性回归方程将实施例2中制备得到的手性聚吡咯电化学传感器和ag/agcl参比电极插入到右氧氟沙星标准溶液中，饱和甘汞电极插入饱和氯化钾溶液中，在右氧氟沙星标准溶液和饱和氯化钾溶液间搭建盐桥，然后将电极连接到电化学工作站上，常温下采用循环伏安法进行检测，设置电位扫描范围为-0.2～2.4v，扫描速度为0.1v/s，循环圈数为1圈。分别检测上述五个不同浓度右氧氟沙星标准溶液，得各浓度右氧氟沙星标准溶液在1.973v处的氧化峰电流数值(参见下面表1)，根据峰电流数值及标准溶液的浓度绘制右氧氟沙星浓度-电流标准曲线(参见图1)，得到线性回归方程为y＝0.64611x+0.10683，并计算相关系数r2＝0.9998。表14.左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星含量的电化学检测左氧氟沙星原料药：市售左氧氟沙星原料药检测溶液配制：精密称取3.6137g左氧氟沙星原料药，加入30ml上述空白对照液，超声振荡溶解，并用空白对照液定容至50ml，制得检测溶液。将实施例2制备的手性聚吡咯电化学传感器和ag/agcl参比电极插入到该检测溶液中，饱和甘汞电极插入饱和氯化钾溶液中，在检测溶液和饱和氯化钾溶液间搭建盐桥，然后将电极连接到电化学工作站上，常温下采用循环伏安法进行检测，设置电位扫描范围为-0.2～2.4v，扫描速度为0.1v/s，循环圈数为1圈。测得1.973v处的氧化峰电流数值为0.5632ma，带入右氧氟沙星标准曲线方程计算得该检测液中右氧氟沙星的浓度c＝0.7063mmol/l，那么，该3.6137g左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星的含量为12.762mg；则，该左氧氟沙星原料药中右氧氟沙星的含量为3531.6mg/kg。实施例4-7对不同厂家购得的左氧氟沙星原料药，按照实施例3的方法进行检测，结果如下表2所示：表2不同厂家购得的左氧氟沙星原料药检测结果样品编号右氧氟沙星含量(mg/kg)实施例313531.6实施例425188.4实施例533162.9实施例644170.7实施例755149.2试验实施例加标回收率对本发明的检测方法的准确度进行考察：三个加标水平分别为0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l，每个水平的样品进行了3次测定，根据测定量和加标量计算各添加水平的回收率和精密度。结果见下面表3。表3检测方法考察结果右氧氟沙星三个加标水平的平均回收率99.35％-99.74％，方法检出限0.01ppm，说明本方法的测定结果可靠。当前第1页12