一种测定大鼠肝组织中槲皮素含量的检测方法与流程

本发明涉及医药化学检测领域，更具体地说，本发明涉及一种大鼠肝组织中槲皮素的检测方法。

背景技术：

槲皮素是一种黄酮类物质，其广泛存在于各种植物中。一般从天然产物(如菊花、银杏、槐花和蒲公英等)中提取而来。已有研究表明，槲皮素具有保护肝脏、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和扩血管降血压等药理作用。槲皮素还能够对神经性炎症和记忆缺陷起到一定的保护作用。在槲皮素纳米粒对小鼠肝癌实体瘤的研究中，从肝匀浆中槲皮素含量、肿瘤体积增长量和肿瘤病理切片染色结果得出槲皮素对肝肿瘤有明显的抑制作用。用萘乙硫氰酸酯灌胃小鼠致其诱发胆汁淤积性肝病，再用槲皮素进行干预治疗，结果发现槲皮素能减少有害胆汁的产生并能使多余有害胆汁排出肝脏从而达到保护肝的作用。槲皮素具有清除活性氧自由基的能力，通过槲皮素对大鼠慢性酒精性肝损伤的实验得出槲皮素能够使肝损伤后机体氧化系统中清除自由基重要酶sod和gsh的含量升高，从而提高系统的氧化能力。机体中铁过载是2型糖尿病的一个诱因，槲皮素能够与铁螯合降低铁过载从而使铁过载诱发的2型糖尿病得到改善。目前槲皮素由于其药效的多样性成为众多学者研究的对象，机体中槲皮素的含量测定是众多研究的基础；肝是代谢的主要场所，因此本实验的目的是建立测定肝组织中槲皮素含量的方法。

目前，关于测定生物样品中槲皮素含量的报道并不多见，测定生物样品中槲皮素的含量多采用高效液相色谱法。一般通过优化色谱条件和样品预处理方法可提高高效液相色谱法测定结果的准确度。需要对样品进行预处理以减少或排除内源性物质对测定的干扰。根据样品的理化性质进行预处理，既可减少杂质的干扰又可对待测样品进行浓集。对生物样品中药物的提取方法包括固相萃取和液液萃取，前者提取率能达到80％以上但成本高，后者的提取率普遍较低。有学者采用液液萃取法提取肝组织样品中的槲皮素等药效成分，结果发现提取效率不佳，导致定量限较高。因此本研究设想通过对预处理条件进行优化从而增加提取的效率，建立一种灵敏度高的测定肝组织中槲皮素含量的方法。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种检测大鼠肝组织中槲皮素含量的方法。

为了实现根据本发明的这些目的，提供了一种测定大鼠肝组织中槲皮素含量的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、标准品的配制；

步骤二、大鼠灌胃槲皮素及取样；

步骤三、除肝组织样品中的蛋白质；

步骤四、用乙酸乙酯对样品进行萃取浓缩；

步骤五、hplc-pad分离测定肝组织样品中槲皮素；

步骤六、结果计算。

优选的是，步骤一中对标准品的配制具体方法为：

以槲皮素和木犀草素为标准品，分别用甲醇配制成浓度为1.0mg.ml^-1的储备液，备用。

优选的是，步骤二中大鼠灌胃槲皮素及取样的具体方法为：

取雌雄大鼠各半，禁食不禁水，24h后分别灌胃给予槲皮素混悬水溶液(20mg·kg^-1体重)，6h后剖腹取肝，得肝组织样品。肝组织用生理盐水洗去残血，吸干水分，称重，在玻璃匀浆器中加入1:1(m/v)体积的去离子水进行匀浆，匀浆液置于-80℃冰箱内保存备用。

优选的是，步骤三中除肝组织中蛋白质的具体方法为：

取步骤二中的肝组织匀浆100μl，加入木犀草素内标溶液40μl(10μg·ml^-1)，加入与肝组织匀浆液体积比为1:5的500μl乙腈，涡旋混和3min以沉淀蛋白；

优选的是，步骤四中用乙酸乙酯对样品进行萃取浓缩的具体方法为：

将步骤三中处理得到的样品加入2.0ml乙酸乙酯，涡旋3min，10000×g，4℃离心10min，取上清液于78℃水浴锅中挥干乙酸乙酯，用50μl甲醇复溶供hplc-pad测定。

优选的是，步骤五中hplc-pad分离测定肝组织样品中槲皮素，测定条件如下：

检测器：日本岛津二极管阵列检测器spd-m20a；

色谱柱：依利特c18(uscl027770，4.6mm×250mm,5μm)；

流动相a：甲醇；

流动相b：磷酸水溶液，ph＝3.0；

等度洗脱，洗脱程序为：a:b＝55:45；

柱温：30℃；

流速：1.0ml·min^-1；

检测波长：380nm；

进样量：20μl。

优选的是，步骤六中结果计算具体为

按公式(1)计算样品中槲皮素的含量；

y＝1.5764x+0.1301(1)

式中：

y:待测物与内标物质的峰面积之比；

x:待测物的浓度，单位为微克每毫升。

1、本发明提供的pda全波长紫外检测器稳定性好，灵敏度好。

2、采用本发明的大鼠肝组织中槲皮素的测定，检测过程简单方便，可实现实际样品中槲皮素的快速检测。

本发明的其他优点、目标和特征部分通过下面的说明体现。

附图说明

图1为本发明所述实施例中槲皮素标准品的高效液相色谱图。其中：1号峰为槲皮素、2号峰为木犀草素。

图2为本发明所述实施例测定大鼠肝组织中槲皮素的高效液相色谱图。其中：1号峰为槲皮素、2号峰为木犀草素。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式做进一步的描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

＜实施例＞

1仪器

高效液相色谱仪(日本岛津)

2试剂

水：超纯水(过0.45μm水系微孔滤膜)。

甲醇：美国tedia公司色谱纯甲醇(过0.45μm有机系微孔滤膜)。

磷酸水溶液：用磷酸调配超纯水的ph＝3.0(过0.45μm水系微孔滤膜)。

标准品：槲皮素(中国食品药品检定研究院)、木犀草素(中国食品药品检定研究院)。

3检测方法

(1)标准品和供试样品溶液的制备：

a)标准品溶液的制备：

称取槲皮素和木犀草素标准品适量，分别用甲醇溶解配制成浓度为1mg.ml^-1的储备液，分装置于-20℃冰箱内保存备用，临用时用甲醇溶液稀释成所需浓度。

b)供试样品溶液的制备：

大鼠肝组织匀浆后分装于1.5ml离心管中，放置于-80℃环境中冻存。取100μl上述肝组织匀浆样品，加入木犀草素内标溶液40μl(10μg.ml^-1)，加入与肝组织匀浆液体积比为1:5的500μl乙腈，涡旋混和3min沉淀蛋白，再加入2.0ml乙酸乙酯，涡旋3min，10000×g，4℃离心10min，取上清液于78℃水浴锅中挥干乙酸乙酯，用50μl甲醇复溶，供hplc-pad测定。

(2)高效液相色谱检测

色谱条件：检测器：岛津二极管阵列紫外检测器spd-m20a；色谱柱：依利特c18(uscl027770，4.6mm×250mm,5μm)；柱温：30℃；流速：1.0ml.min^-1；检测波长：380nm；进样量：20μl。流动相：甲醇:磷酸水溶液(ph＝3.0)＝55:45(v:v)

将标准品溶液在0.20-8.0μg.ml^-1范围内配制6个不同浓度的系列标准溶液，分别进样后，以槲皮素与木犀草素峰面积的比值作为y，以待测物的浓度为x进行线性回归，线性关系r²＝0.9991。

将标准品和样品溶液分别进样，根据标准品的保留时间定性样品中各组分的色谱峰；以内标法对样品中的槲皮素的含量进行计算。

4结果计算

按公式(1)计算样品中槲皮素的含量；

y＝1.5764x+0.1301(1)

式中：

y:待测物与内标物质的峰面积之比；

x:待测物的浓度，单位为微克每毫升；

5专属性

实验槲皮素的测定专利条件下，在空白肝组织样品溶液中，在待测物和内标物的保留时间处，未见峰。表明此方法具有良好的专属性。

6线性和灵敏度

实验槲皮素在专利条件下的线性，标准曲线表明在广泛浓度内(0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，8.0μg.ml^-1)和浓度有线性关系(r²＝0.9991。槲皮素的保留时间和线性范围，回归方程见表1(检测限信噪比≥3和定量限信噪比≥10))。

表1槲皮素的保留时间及线性回归方程

7回收率

回收率通过测定向空白肝组织样品中加入已知量的标准品得出。加入1.0μg.ml^-1，4.0μg.ml^-1，8.0μg.ml^-1三个浓度的标准品，每个浓度平行5份，在一天内测定，用于计算回收率和日内精密度。

8精密度

精密度通过测定向空白肝组织样品中加入已知量的标准品得出。加入1.0μg.ml^-1，4.0μg.ml^-1，8.0μg.ml^-1三个浓度的标准品，每个浓度平行3份，连续测定3天，用于计算日间精密度。用相对标准偏差来表示精密度。

大鼠空白肝组织中添加1.0μg.ml^-1，4.0μg.ml^-1，8.0μg.ml^-1三个浓度的槲皮素标准品的回收率和精密度见表2

表2肝组织样品加标的回收率和精密度(均值±标准偏差)

9稳定性

稳定性通过向空白肝组织样品中加入已知量的标准品得出，加入1.0μg.ml^-1，4.0μg.ml^-1，8.0μg.ml^-1三个浓度的标准品，每个浓度平行3份，分别于4℃放置0h，24h和48h后测定，当减少量小于10％时，可认为样品稳定。大鼠肝组织中添加1.0μg.ml^-1，4.0μg.ml^-1，8.0μg.ml^-1三个浓度的标准品在4℃条件下的放置稳定性见表3。

表3肝组织样品加标的稳定性

由以上实例可以看出，本发明实施例通过对大鼠肝组织中槲皮素进行检测，方法有较高的灵敏度、准确度和精密度。