检测食源性致病菌的方法、用于SERS法检测食源性致病菌的试剂及其制备方法与流程

本公开涉及致病菌检测技术，具体地，涉及一种检测食源性致病菌的方法、用于sers法检测食源性致病菌的试剂及其制备方法。

背景技术：

食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，对人类健康造成很大危害，是食品安全的重大隐患。而且当前致病菌污染日趋严重，在医药、食品、环境等方面已经引起人们高度的重视。大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌是种主要的致病菌，可以引起肠胃炎，伤寒、霍乱，猩红热，菌痢等疾病，可能危及人类生命。目前对致病菌的检测已做出了很大的努力，主要包括传统的微生物检验技术、分子生物学技术、仪器分析技术和免疫学技术法等，现有的这些分析方法虽各有优势，但在一定的局限性，或者前处理步骤复杂、时间长，或者仪器设备庞大昂贵、缺乏更高的灵敏度，受环境因素影响变化较大，不能对微生物进行灵敏快速分析等，建立一种高效灵敏地检测方法的体系是目前迫切需要的。

由于致病菌可以特异性的结合适配体形成很强很稳定的结构，近些年大量的基于适配体的致病菌检测方法被大量的发明。但这些传感方法存在操作繁琐，耗时长，选择性差等缺点。如何快速、简单地检测致病菌的技术问题亟待解决。

技术实现要素：

本公开的一个目的是提供一种基于适配体dna调控的金纳米棒的生长成sers探针并用于检测食源性致病菌的方法，通过该方法能够灵敏、准确且快速地检测出待测溶液中是否含有食源性致病菌。

本公开的另一个目的是提供一种用于sers法检测食源性致病菌的试剂及其制备方法。

为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种检测食源性致病菌的方法，该方法包括以下步骤：

s1、将十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合后进行第一反应，得到第一混合液；

s2、将步骤s1得到的所述第一混合液与含有十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的第二混合液混合后进行第二反应，收集固体产物；将所述固体产物与水混合，得到第三混合液；

s3、将步骤s2得到的所述第三混合液与适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液混合后进行第三反应，得到用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液；

s4、将含有纳米磁球的液体与所述适配体dna溶液混合，得到第四混合液；

s5、将步骤s3得到的所述用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液、步骤s4得到的所述第四混合液和待检测溶液混合后进行测试反应，磁分离后得到食源性致病菌检测混合液；

s6、将步骤s5得到的所述食源性致病菌检测混合液进行sers检测。

可选地，步骤s1中，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液的摩尔比为1000：(1-10)：(3-12)；

所述第一反应的条件为：温度为25-30℃，时间为1-3h；和/或，

步骤s2中，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的摩尔比为1000：(1-25)：(0.1-2.4)：(1-14)；

所述第一混合液和所述第二混合液的体积比为(1-5)：1000；

所述第二反应的条件为：温度为25-37℃，时间为1-3h；

所述固体产物和水的重量比为1：(100-1000)。

可选地，步骤s3中，所述适配体dna溶液中的dna序列为5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′、5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′或5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′；

所述第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比为100：(1-10)：(0.05-1)：(0.1-2)：(0.5-10)；

所述第三反应的条件为：温度为25-30℃，时间为1.5-5h；和/或，

步骤s4中，所述含有纳米磁球的液体和适配体dna溶液的体积比为100：(2-10)；

所述含有纳米磁球的液体中的纳米磁球为fe3o4和/或fe2o3；和/或，

步骤s5中，所述待检测溶液、用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液和第四混合液的体积比为1：(20-200)：(20-200)；

所述测试反应条件为：温度为25-30℃，时间为0.5-2h。

可选地，所述十六烷基三甲溴化铵溶液的浓度为0.02-1mol/l；所述氯金酸溶液的浓度为0.1-10mol/l；所述硼氢化钠溶液的浓度为1-100mmol/l；所述硝酸银溶液的浓度为1-10mmol/l；所述抗坏血酸溶液的浓度为50-100mmol/l；所述适配体dna溶液的浓度为0.1-10μmol/l；所述罗丹明溶液的浓度为0.1-10μmol/l；所述羟胺盐酸盐溶液的浓度为0.1-1mol/l；所述含有纳米磁球的液体中纳米磁球的浓度为50-500μg/ml。

可选地，所述食源性致病菌包括大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌中的至少一种。

可选地，该方法还包括：将步骤s5得到的所述食源性致病菌检测混合液进行电镜检测和/或紫外检测。

本公开第二方面：提供一种制备用于sers法检测食源性致病菌的试剂的方法，该方法包括以下步骤：

s1、将十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合后进行第一反应，得到第一混合液；

s2、将步骤s1得到的所述第一混合液与含有十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的第二混合液混合后进行第二反应，收集固体产物；将所述固体产物与水混合，得到第三混合液；

s3、将步骤s2得到的所述第三混合液与适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液混合后进行第三反应，得到用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液；

s4、将含有纳米磁球的液体与所述适配体dna溶液混合，得到第四混合液；

s5、将步骤s3得到的所述用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液和步骤s4得到的所述第四混合液混合，得到用于sers法检测食源性致病菌的试剂。

可选地，步骤s1中，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液的摩尔比为1000：(1-10)：(3-12)；

所述第一反应的条件为：温度为25-30℃，时间为1-3h；和/或，

步骤s2中，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的摩尔比为1000：(1-25)：(0.1-2.4)：(1-14)；

所述第一混合液和所述第二混合液的体积比为(1-5)：1000；

所述第二反应的条件为：温度为25-37℃，时间为1-3h；

所述固体产物和水的重量比为1：(100-1000)；和/或，

步骤s3中，所述适配体dna溶液中的dna序列为5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′、5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′或5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′；

所述第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比为100：(1-10)：(0.05-1)：(0.1-2)：(0.5-10)；

所述第三反应的条件为：温度为25-30℃，时间为1.5-5h；和/或，

步骤s4中，所述含有纳米磁球的液体和适配体dna溶液的体积比为100：(2-10)；

所述含有纳米磁球的液体中的纳米磁球为fe3o4和/或fe2o3；和/或，

步骤s5中，所述用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液和第四混合液的体积比为1：(1-10)；和/或，

所述十六烷基三甲溴化铵溶液的浓度为0.02-1mol/l；所述氯金酸溶液的浓度为0.1-10mol/l；所述硼氢化钠溶液的浓度为1-100mmol/l；所述硝酸银溶液的浓度为1-10mmol/l；所述抗坏血酸溶液的浓度为50-100mmol/l；所述适配体dna溶液的浓度为0.1-10μmol/l；所述罗丹明溶液的浓度为0.1-10μmol/l；所述羟胺盐酸盐溶液的浓度为0.1-1mol/l；所述含有纳米磁球的液体中纳米磁球的浓度为50-500μg/ml。

可选地，所述食源性致病菌包括大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌中的至少一种。

本公开第三方面：提供由本公开第二方面所述的方法制备得到的用于sers法检测食源性致病菌的试剂。

通过上述技术方案，本公开通过适配体dna调控金纳米棒生长，提高了纳米颗粒的生物相容性及光学活性，同时适配体dna可作为食源性致病菌的识别元件，生长的同时将拉曼信号分子包裹，提高了拉曼信号的强度和稳定性，利用dna修饰的金纳米棒sers探针，可实现对食源性致病菌高灵敏度快速地检测，对环境及食品中的致病菌的检测有较大的意义。采用本公开的方法制备得到的用于sers法检测食源性致病菌的试剂能够灵敏、准确且快速地检测出待测溶液中是否含有食源性致病菌，此外，还具有成本低廉、易携带、能用于现场检测的优点。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是本公开的检测食源性致病菌的方法的流程示意图。

图2是本公开的方法中金纳米棒探针的tem图。

图3是实施例2和对比例3中对待检测溶液进行sers检测得到的对比图。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面：提供一种检测食源性致病菌的方法，参考图1，该方法包括以下步骤：

s1、将十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合后进行第一反应，得到第一混合液；

s2、将步骤s1得到的所述第一混合液与含有十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的第二混合液混合后进行第二反应，收集固体产物；将所述固体产物与水混合，得到第三混合液；

s3、将步骤s2得到的所述第三混合液与适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液混合后进行第三反应，得到用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液；

s4、将含有纳米磁球的液体与所述适配体dna溶液混合，得到第四混合液；

s5、将步骤s3得到的所述用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液、步骤s4得到的所述第四混合液和待检测溶液混合后进行测试反应，磁分离后得到食源性致病菌检测混合液；

s6、将步骤s5得到的所述食源性致病菌检测混合液进行sers检测。

本公开的方法所检测的所述食源性致病菌可以包括大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌中的至少一种。

根据本公开第一方面，步骤s1中，将所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合进行第一反应，能够得到含有球状金纳米颗粒的所述第一混合液。进一步地，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液的摩尔比可以为1000：(1-10)：(3-12)；所述第一反应的条件可以为：温度为25-30℃，时间为1-3h。所述十六烷基三甲溴化铵溶液的浓度可以为0.02-1mol/l；所述氯金酸溶液的浓度可以为0.1-10mol/l；所述硼氢化钠溶液的浓度可以为1-100mmol/l。

根据本公开第一方面，步骤s2中，首先将所述第一混合液与第二混合液混合进行第二反应，然后可以将第二反应后的反应混合液进行离心分离，得到固体产物，所述固体产物中含有金纳米棒，该金纳米棒是一种长度几十纳米的棒状金纳米颗粒。金纳米棒有很多独特的性质，尤其是可见范围内有纵向表面等离子共振吸收这一特点使它应用广泛。纵向表面等离子共振吸收对金纳米棒的长径比非常敏感。金纳米棒长径比很小的变化就会使得金纳米棒吸收明显变化，不仅吸光度会降低而且表面等离子体特征吸收峰也会发生峰位的移动。进一步地，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的摩尔比可以为1000：(1-25)：(0.1-2.4)：(1-14)；所述第一混合液和所述第二混合液的体积比可以为(1-5)：1000；所述第二反应的条件可以为：温度为25-37℃，时间为1-3h。所述十六烷基三甲溴化铵溶液的浓度可以为0.02-1mol/l；所述氯金酸溶液的浓度可以为0.1-10mol/l；所述硝酸银溶液的浓度可以为1-10mmol/l；所述抗坏血酸溶液的浓度可以为50-100mmol/l。将所述固体产物与水混合，得到第三混合液；所述固体产物和水的重量比可以为1：(100-1000)。

根据本公开第一方面，步骤s3中，通过将所述第三混合液与适配体dna溶液、罗丹明溶液(rh6g)、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液混合后进行第三反应，能够通过特异的适配体dna进一步调节步骤s2中得到的金纳米棒的生长，同时包裹拉曼信号分子，得到用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液。通过特异适配体dna的调节作用，可以控制金纳米棒的长径比，改变金纳米棒的等吸收峰、等离体性能和光热性能，优化拉曼检测信号，并使金纳米棒表面连接可特异识别食源性致病菌的探针，金纳米棒探针的tem图参考图2。进一步地，所述适配体dna溶液中的dna序列可以根据所要检测的食源性致病菌的种类进行选取，例如，所述适配体dna溶液中的dna序列可以为5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′(seqidno.1，采用该dna序列制备的拉曼探针溶液可特异识别大肠杆菌)、5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′(seqidno.2，采用该dna序列制备的拉曼探针溶液可特异识别副溶血弧菌)或5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′(seqidno.3，采用该dna序列制备的拉曼探针溶液可特异识别沙门氏菌)。进一步地，所述第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液(rh6g)、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比可以为100：(1-10)：(0.05-1)：(0.1-2)：(0.5-10)；所述第三反应的条件可以为：温度为25-30℃，时间为1.5-5h。所述适配体dna溶液的浓度可以为0.1-10μmol/l；所述罗丹明溶液的浓度可以为0.1-10μmol/l；所述羟胺盐酸盐溶液的浓度可以为0.1-1mol/l；所述氯金酸溶液的浓度可以为0.1-10mol/l。

根据本公开第一方面，步骤s4中，通过将含有纳米磁球的液体与所述适配体dna溶液混合，能够将识别不同食源性致病菌的适配体dna分子连接在纳米磁球表面，进而可特异结合食源性致病菌，实现对溶液中致病菌的分离并浓缩。进一步地，所述含有纳米磁球的液体和适配体dna溶液的体积比可以为100：(2-10)。所述含有纳米磁球的液体中的纳米磁球可以为fe3o4和/或fe2o3。所述含有纳米磁球的液体中纳米磁球的浓度可以为50-500μg/ml。所述适配体dna溶液中的dna序列与步骤s3中相对应，此处不再赘述，所述适配体dna溶液的浓度可以为0.1-10μmol/l。将所述含有纳米磁球的液体与所述适配体dna溶液混合后，可通过磁分离去除过量的适配体dna，得到所述第四混合液。

根据本公开第一方面，步骤s5中，所述待检测溶液、用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液和第四混合液的体积比可以为1：(20-200)：(20-200)；所述测试反应条件可以为：温度为25-30℃，时间为0.5-2h。

根据本公开第一方面，步骤s6中，将所述食源性致病菌检测混合液进行sers检测，即可灵敏、准确且快速地检测出待测溶液中是否含有食源性致病菌。所述sers检测的条件和方法可以为本领域常规的。当sers检测结果中出现罗丹明的特征峰时，说明待检测溶液中含有所述食源性致病菌；当sers检测结果中没有出现罗丹明的特征峰时，说明待检测溶液中不含所述食源性致病菌。

根据本公开第一方面，为了进一步提高检测结果的准确度，该方法还可以包括：将步骤s5得到的所述食源性致病菌检测混合液进行电镜检测和/或紫外检测。进一步地，所述电镜检测可以包括透射电镜检测、高分辨率透射电镜检测和扫描电镜检测中的至少一种。所述电镜检测和紫外检测的检测方法可以为本领域常规的。例如，进行电镜检测时，可以取适量所述食源性致病菌检测混合液滴加至碳膜铜网上，待铜网上溶剂挥发干净后对粘附有食源性致病菌检测混合液中溶质的制样品通过透射电镜进行检测；当电镜检测图像为球状纳米粒子和食源性致病菌相连的结构时，则说明待检测溶液中不含食源性致病菌；当电镜检测图像为状纳米粒子、食源性致病菌和金纳米棒相连的复合结构时，则说明待检测溶液中含有食源性致病菌。当紫外检测结果中具有特定的吸收峰(如在500-600nm、700-800nm处有两个吸收峰)时，则说明待检测溶液中含有食源性致病菌；当紫外检测结果中未出现特定的吸收峰时，则说明待检测溶液中不含有食源性致病菌。此外，还可以通过观察所述食源性致病菌检测混合液的颜色进行判断，例如，当所述食源性致病菌检测混合液的颜色与含有纳米磁球的液体的颜色基本保持一致(例如采用含有纳米fe3o4的液体所得到的所述食源性致病菌检测混合液为黄褐色溶液)时，则说明待检测溶液中不含所述食源性致病菌；而当所述食源性致病菌检测混合液的颜色为深蓝色溶液时，则说明待检测溶液中含有所述食源性致病菌。

本公开第二方面：提供一种制备用于sers法检测食源性致病菌的试剂的方法，该方法包括以下步骤：

s1、将十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合后进行第一反应，得到第一混合液；

s2、将步骤s1得到的所述第一混合液与含有十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的第二混合液混合后进行第二反应，收集固体产物；将所述固体产物与水混合，得到第三混合液；

s3、将步骤s2得到的所述第三混合液与适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液混合后进行第三反应，得到用于检测致病菌的拉曼探针溶液；

s4、将含有纳米磁球的液体与所述适配体dna溶液混合，得到第四混合液；

s5、将步骤s3得到的所述用于检测致病菌的拉曼探针溶液和步骤s4得到的所述第四混合液混合，得到用于sers法检测食源性致病菌的试剂。

本公开所检测的所述食源性致病菌可以包括大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌中的至少一种。

根据本公开第二方面，步骤s1中，将所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合进行第一反应，可以得到含有球状金纳米颗粒的所述第一混合液。进一步地，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液的摩尔比可以为1000：(1-10)：(3-12)；所述第一反应的条件可以为：温度为25-30℃，时间为1-3h。所述十六烷基三甲溴化铵溶液的浓度可以为0.02-1mol/l；所述氯金酸溶液的浓度可以为0.1-10mol/l；所述硼氢化钠溶液的浓度可以为1-100mmol/l。

根据本公开第二方面，步骤s2中，首先将所述第一混合液与第二混合液混合进行第二反应，然后可以将进行第二反应后的反应混合液进行离心分离，得到固体产物，所述固体产物中含有金纳米棒，该金纳米棒是一种长度几十纳米的棒状金纳米颗粒。金纳米棒有很多独特的性质，尤其是可见范围内有纵向表面等离子共振吸收这一特点使它应用广泛。纵向表面等离子共振吸收对金纳米棒的长径比非常敏感。金纳米棒长径比很小的变化就会使得金纳米棒吸收明显变化，不仅吸光度会降低而且表面等离子体特征吸收峰也会发生峰位的移动。进一步地，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的摩尔比可以为(1000-5000)：(5-25)：(0.4-2.4)：(7-14)；所述第一混合液和所述第二混合液的体积比可以为(1-5)：1000；所述第二反应的条件可以为：温度为25-37℃，时间为1-3h。所述十六烷基三甲溴化铵溶液的浓度可以为0.02-1mol/l；所述氯金酸溶液的浓度可以为0.1-10mol/l；所述硝酸银溶液的浓度可以为1-10mmol/l；所述抗坏血酸溶液的浓度可以为50-100mmol/l。将所述固体产物与水混合，得到第三混合液；所述固体产物和水的重量比可以为1：(100-1000)。

根据本公开第二方面，步骤s3中，通过将所述第三混合液与适配体dna溶液、罗丹明溶液(rh6g)、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液混合后进行第三反应，可以通过特别的适配体dna进一步调节步骤s2中得到的金纳米棒的生长，同时包裹拉曼信号分子，得到用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液。通过特异适配体dna的调节作用，可以控制金纳米棒的长径比，改变金纳米棒的等吸收峰、等离体性能和光热性能，优化拉曼检测信号，并使金纳米棒表面连接可特异识别食源性致病菌的探针。进一步地，所述适配体dna溶液中的dna序列可以根据所要检测的食源性致病菌的种类进行选取，例如，所述适配体dna溶液中的dna序列可以为5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′(seqidno.1，采用该dna序列制备的拉曼探针溶液可特异识别大肠杆菌)、5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′(seqidno.2，采用该dna序列制备的拉曼探针溶液可特异识别副溶血弧菌)或5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′(seqidno.3，采用该dna序列制备的拉曼探针溶液可特异识别沙门氏菌)。进一步地，所述第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液(rh6g)、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比可以为100：(1-10)：(0.05-1)：(0.1-2)：(0.5-10)；所述第三反应的条件可以为：温度为25-30℃，时间为1.5-5h。所述适配体dna溶液的浓度可以为0.1-10μmol/l；所述罗丹明溶液的浓度可以为0.1-10μmol/l；所述羟胺盐酸盐溶液的浓度可以为0.1-1mol/l；所述氯金酸溶液的浓度可以为0.1-10mol/l。

根据本公开第二方面，步骤s4中，通过将含有纳米磁球的液体与所述适配体dna溶液混合，能够将识别不同食源性致病菌的适配体dna分子连接在纳米磁球表面，进而可特异结合食源性致病菌，实现对溶液中致病菌的分离并浓缩。进一步地，所述含有纳米磁球的液体和适配体dna溶液的体积比可以为100：(2-10)。所述含有纳米磁球的液体中的纳米磁球可以为fe3o4和/或fe2o3。所述含有纳米磁球的液体中纳米磁球的浓度可以为50-500μg/ml。所述适配体dna溶液中的dna序列与步骤s3中相对应，此处不再赘述。所述适配体dna溶液的浓度可以为0.1-10μm/l。将所述含有纳米磁球的液体与所述适配体dna溶液混合后，可通过磁分离去除过量的适配体dna，得到所述第四混合液。

根据本公开第二方面，步骤s5中，所述用于检测食源性致病菌的拉曼探针溶液和第四混合液的体积比可以为1：(1-10)。

本公开第三方面：提供由本公开第二方面所述的方法制备得到的用于sers法检测食源性致病菌的试剂。本公开的用于sers法检测食源性致病菌的试剂能够灵敏、准确且快速地检测出待测溶液中是否含有食源性致病菌，此外，还具有成本低廉、易携带、能用于现场检测的优点。

以下结合实施例进一步详细说明本发明，以下实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例中，采用horibajobinyvon公司生产的labramhrevolution拉曼光谱仪对大肠杆菌检测混合液、副溶血弧菌检测混合液和沙门氏菌检测混合液分别进行sers检测，使用的激发光由633nm氣氖激光器提供，配合高精度三维拉曼扫描成像样品台和共聚焦光学显微镜使用，可以检测的拉曼频移范围在100-6000cm^-1，光谱分辨率小于1cm^-1。检测方法为：用毛细管吸取少量样品，置于拉曼光谱仪的共聚焦显微镜下用50x物镜观察，使光斑聚焦于毛细管内壁。拉曼光谱仪使用633nm波长激光作为泵浦光，信号采集时间为10s。

采用hitachi公司生产的ht-7700型tem电镜对大肠杆菌检测混合液、副溶血弧菌检测混合液和沙门氏菌检测混合液分别进行电镜检测，检测条件为：仪器分辨率为0.204nm，温度25℃；检测方法为：取反应后液体滴加在碳支持膜上，干燥后在tem电镜下观察。

采用shimadzu公司生产的uv-1750紫外可见分光光度计，对大肠杆菌检测混合液、副溶血弧菌检测混合液和沙门氏菌检测混合液分别进行紫外检测，仪器型号为：检测条件为：检测波长400-1000nm，温度25℃，检测方法为：用移液枪取100ul待测溶液放于比色皿中，放于仪器中检测紫外光谱。

实施例1

(1)按照如下步骤制备用于检测食源性致病菌的大肠杆菌检测混合液、副溶血弧菌检测混合液和沙门氏菌检测混合液：

向十六烷基三甲溴化铵溶液(浓度为0.5mol/l)中依次加入氯金酸溶液(浓度为2mol/l)和硼氢化钠溶液(浓度为50mmol/l)，十六烷基三甲溴化铵、氯金酸和硼氢化钠的摩尔比为1000：5：5，在27℃反应2h，得到第一混合液。向十六烷基三甲溴化铵溶液(浓度为0.5mol/l)中依次加入氯金酸溶液(浓度为2mol/l)、硝酸银溶液(浓度为5mmol/l)和抗坏血酸溶液(浓度为70mmol/l)，十六烷基三甲溴化铵、氯金酸、硝酸银和抗坏血酸的摩尔比为1000：10：2：10，得到第二混合液，将上述第一混合液加入至第二混合液中(第一混合液和第二混合液的体积比为3：1000)，在32℃反应2h，然后离心分离，收集离心沉淀物即固体产物。将该离心沉淀物按照与水的重量比为1：200分散至水中，得到第三混合液。

向所述第三混合液中依次加入5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′(seqidno.1)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)、罗丹明溶液(浓度为5μmol/l)、羟胺盐酸盐溶液(浓度为0.5mol/l)和氯金酸溶液(浓度为5mol/l)，第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比为100：2：1：0.5：2，在28℃反应3h，得到用于检测大肠杆菌的拉曼探针溶液。

向所述第三混合液中依次加入5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′(seqidno.2)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)、罗丹明溶液(浓度为5μmol/l)、羟胺盐酸盐溶液(浓度为0.5mol/l)和氯金酸溶液(浓度为5mol/l)，第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比为100：2：1：0.5：2，在28℃反应3h，得到用于检测副溶血弧菌的拉曼探针溶液。

向所述第三混合液中依次加入5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′(seqidno.3)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)、罗丹明溶液(浓度为5μmol/l)、羟胺盐酸盐溶液(浓度为0.5mol/l)和氯金酸溶液(浓度为5mol/l)，第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比为100：2：1：0.5：2，在28℃反应3h，得到用于检测沙门氏菌的拉曼探针溶液。

将含有纳米fe3o4的液体(浓度为200μg/ml)与5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′(seqidno.1)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)按体积比为100：2混合，得到第四混合液；将上述用于检测大肠杆菌的拉曼探针溶液和第四混合液(体积比为1:1)混合，得到用于sers法检测大肠杆菌的试剂。将第一待检测溶液和该试剂按第一待检测溶液、用于检测大肠杆菌的拉曼探针溶液和第四混合液体积比为1：150：150混合后在28℃进行测试反应1h，磁分离后得到大肠杆菌检测混合液。

将含有纳米fe3o4的液体(浓度为200μg/ml)与5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′(seqidno.2)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)体积比为100：2混合，得到第五混合液；将上述用于检测副溶血弧菌的拉曼探针溶液和第五混合液(体积比为1:1)混合，得到用于sers法检测副溶血弧菌的试剂。将第一待检测溶液和该试剂按第一待检测溶液、用于检测副溶血弧菌的拉曼探针溶液和第五混合液体积比为1：150：150混合后在28℃进行测试反应1h，磁分离后得到副溶血弧菌检测混合液。

将含有纳米fe3o4的液体(浓度为200μg/ml)与5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′(seqidno.3)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)体积比为100：2混合，得到第六混合液；将上述用于检测沙门氏菌的拉曼探针溶液和第六混合液(体积比为1:1)混合，得到用于sers法检测沙门氏菌的试剂。将第一待检测溶液和该试剂按第一待检测溶液、用于检测沙门氏菌的拉曼探针溶液和第六混合液体积比为1：150：150混合后在28℃进行测试反应0.5h，磁分离后得到沙门氏菌检测混合液。

(2)对第一待检测溶液进行检测，判断第一待检测溶液中是否含有大肠杆菌、副溶血弧菌或沙门氏菌：

上述大肠杆菌检测混合液为黄褐色溶液，副溶血弧菌检测混合液为深蓝色溶液，沙门氏菌检测混合液为黄褐色溶液。

sers检测结果：大肠杆菌检测混合液在623cm^-1处没有罗丹明的特征峰，副溶血弧菌检测混合液在623cm^-1处有罗丹明的特征峰，沙门氏菌检测混合液在623cm^-1处没有罗丹明的特征峰，检测结果为第一待检测溶液中没有大肠杆菌和沙门氏菌，而含有副溶血弧菌。

电镜检测结果：大肠杆菌检测混合液的电镜检测图像为球状纳米粒子和致病菌相连的结构，副溶血弧菌检测混合液的电镜图像中则为球状纳米粒子、致病菌和金纳米棒的复合结构，沙门氏菌检测混合液的电镜检测图像为球状纳米粒子和致病菌相连的结构，检测结果为第一待检测溶液中没有大肠杆菌和沙门氏菌，而含有副溶血弧菌。

紫外检测结果：副溶血弧菌检测混合液在500-600nm、700-800nm有两个吸收峰，而大肠杆菌检测混合液、沙门氏菌检测混合液均未检测到吸收峰，检测结果为第一待检测溶液中没有大肠杆菌和沙门氏菌，而含有副溶血弧菌。

实施例2

(1)按照如下步骤制备用于检测食源性致病菌的大肠杆菌检测混合液、副溶血弧菌检测混合液和沙门氏菌检测混合液：

向十六烷基三甲溴化铵溶液(浓度为0.5mol/l)中依次加入氯金酸溶液(浓度为6mol/l)和硼氢化钠溶液(浓度为80mmol/l)，十六烷基三甲溴化铵、氯金酸和硼氢化钠的摩尔比为1000：5：10，在27℃反应2h，得到第一混合液。向十六烷基三甲溴化铵溶液(浓度为0.5mol/l)中依次加入氯金酸溶液(浓度为2mol/l)、硝酸银溶液(浓度为5mmol/l)和抗坏血酸溶液(浓度为70mmol/l)，十六烷基三甲溴化铵、氯金酸、硝酸银和抗坏血酸的摩尔比为1000：20：2：12，得到第二混合液，将上述第一混合液加入至第二混合液中(第一混合液和第二混合液的体积比为3：1000)，在32℃反应2h，然后离心分离，收集离心沉淀物即固体产物。将该离心沉淀物按照与水的重量比为1：800分散至水中，得到第三混合液。

向所述第三混合液中依次加入5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′(seqidno.1)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)、罗丹明溶液(浓度为8μmol/l)、羟胺盐酸盐溶液(浓度为0.5mol/l)和氯金酸溶液(浓度为8mol/l)，第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比为100：4：1：0.5：4，在28℃反应3h，得到用于检测大肠杆菌的拉曼探针溶液。

向所述第三混合液中依次加入5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′(seqidno.2)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为8μmol/l)、罗丹明溶液(浓度为5μmol/l)、羟胺盐酸盐溶液(浓度为0.5mol/l)和氯金酸溶液(浓度为8mol/l)，第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比为100：4：1：0.5：4，在28℃反应3h，得到用于检测副溶血弧菌的拉曼探针溶液。

向所述第三混合液中依次加入5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′(seqidno.3)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为8μmol/l)、罗丹明溶液(浓度为5μmol/l)、羟胺盐酸盐溶液(浓度为0.5mol/l)和氯金酸溶液(浓度为8mol/l)，第三混合液、适配体dna溶液、罗丹明溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液的体积比为100：4：1：0.5：4，在28℃反应3h，得到用于检测沙门氏菌的拉曼探针溶液。

将含有纳米fe3o4的液体(浓度为500μg/ml)与5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′(seqidno.1)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)按体积比为100：4混合，得到第四混合液；将上述用于检测大肠杆菌的拉曼探针溶液和第四混合液(体积比为1:1)混合，得到用于sers法检测大肠杆菌的试剂。将第一待检测溶液和该试剂按第一待检测溶液、用于检测大肠杆菌的拉曼探针溶液和第四混合液体积比为1：180：180混合后在25℃进行测试反应1h，磁分离后得到大肠杆菌检测混合液。

将含有纳米fe3o4的液体(浓度为500μg/ml)与5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′(seqidno.2)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)体积比为100：4混合，得到第五混合液；将上述用于检测副溶血弧菌的拉曼探针溶液和第五混合液(体积比为1:1)混合，得到用于sers法检测副溶血弧菌的试剂。将第一待检测溶液和该试剂按第一待检测溶液、用于检测副溶血弧菌的拉曼探针溶液和第五混合液体积比为1：170：170混合后在25℃进行测试反应1h，磁分离后得到副溶血弧菌检测混合液。

将含有纳米fe3o4的液体(浓度为500μg/ml)与5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′(seqidno.3)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液(浓度为5μmol/l)体积比为100：4混合，得到第六混合液；将上述用于检测沙门氏菌的拉曼探针溶液和第六混合液(体积比为1:1)混合，得到用于sers法检测沙门氏菌的试剂。将第一待检测溶液和该试剂按第一待检测溶液、用于检测沙门氏菌的拉曼探针溶液和第六混合液体积比为1：165：165混合后在25℃进行测试反应0.5h，磁分离后得到沙门氏菌检测混合液。

(2)对第一待检测溶液进行检测，判断第一待检测溶液中是否含有大肠杆菌、副溶血弧菌或沙门氏菌：

上述大肠杆菌检测混合液为深蓝色溶液，副溶血弧菌检测混合液为深蓝色溶液，沙门氏菌检测混合液为深蓝色溶液。

sers检测结果见图3，大肠杆菌检测混合液在623cm^-1处有罗丹明的特征峰，副溶血弧菌检测混合液在623cm^-1处有罗丹明的特征峰，沙门氏菌检测混合液在623cm^-1处有罗丹明的特征峰，检测结果为第一待检测溶液中含有大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌。

电镜检测结果：大肠杆菌检测混合液的电镜检测图像为球状纳米粒子、致病菌和金纳米棒的复合结构，副溶血弧菌检测混合液的电镜图像中则为球状纳米粒子、致病菌和金纳米棒的复合结构，沙门氏菌检测混合液的电镜检测图像为球状纳米粒子、致病菌和金纳米棒的复合结构相连的结构，检测结果为第一待检测溶液中含有大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌。

紫外检测结果：大肠杆菌检测混合液、副溶血弧菌检测混合液和沙门氏菌检测混合液在500-600nm、700-800nm均有两个吸收峰，检测结果为第一待检测溶液中含有大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌。

对比例

按照实施例1的方法制备用于大肠杆菌检测混合液、副溶血弧菌检测混合液和沙门氏菌检测混合液，并对第一待检测溶液进行检测，与实施例1的不同之处在于：本对比例中，得到第三混合液后，向第三混合液中仅加入由5′-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgttggctcccgtat-3′(seqidno.1)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液和罗丹明溶液进行反应，即不加入羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液，得到用于检测大肠杆菌的拉曼探针溶液。

向所述第三混合液中仅加入由5′-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagctacgtcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′(seqidno.2)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液和罗丹明溶液进行反应，即不加入羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液，得到用于检测副溶血弧菌的拉曼探针溶液。

向所述第三混合液中仅加入由5′-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′(seqidno.3)组成的核苷酸连接而成的适配体dna溶液和罗丹明溶液进行反应，即不加入羟胺盐酸盐溶液和氯金酸溶液，得到用于检测沙门氏菌的拉曼探针溶液。

本对比例的大肠杆菌检测混合液、副溶血弧菌检测混合液和沙门氏菌检测混合液均为黄褐色溶液，sers图均没有罗丹明的特征峰(见图3)，电镜检测图像均为球状纳米粒子和致病菌相连的结构，紫外检测均未出现吸收峰，检测结果为第一待检测溶液中没有大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌。

测试实施例

通过细菌培养法对第一待检测溶液和第二待检测溶液进行检测：分别将第一待检测溶液和第二待检测溶液放入培养基上进行培养，计数。第一待检测溶液培养后只有副溶血弧菌、没有大肠杆菌和沙门氏菌，第二检测液培养后具有大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌。

通过实施例、对比例和测试实施例的结果可以看出，本公开的方法能够非常准确地测定待检测溶液中是否存在包括大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌在内的食源性致病菌。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110>中国农业科学院农产品加工研究所

<120>检测食源性致病菌的方法、用于sers法检测食源性致病菌的试剂及其制备方法

<130>12520caas-f-lc

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>71

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatggtggtgtt60

ggctcccgtat71

<210>2

<211>88

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctcgctggtcatcccacagct60

acgtcaaaagtgcacgctactttgctaa88

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag40