一种拉曼增强纳米材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种拉曼增强纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，食品的健康与安全越发显得重要。色素作为一种常见添加剂，在食品行业中应用广泛。添加色素可以大大改善食品的色泽品质，进而招揽更多的顾客，尤其是少年儿童。色素按照来源可分为天然色素和合成色素两类。其中天然色素尽管安全性高，但着色效果差、价格较高，在食品行业中应用较少；反观合成色素，其着色力好、不易褪色、成本低，在食品行业中应用广泛。然而，值得一提的是，合成色素具有一定的毒性、致泻性和致癌性。这些毒性主要源于合成色素中的砷、铅、铜、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸盐，它们对人体均可造成不同程度的危害。大量研究报告表明，长期服用含有合成色素的食品，容易引发儿童行为过激、影响其智力发育、并干扰其体内正常生理代谢等。因此，各国对食品中合成色素的添加量都做了严格的规定和限制。例如，我国《食品添加剂使用卫生标准》规定，日落黄、柠檬黄在饮料中的最大用量为0.1g/kg，诱惑红的最大用量为0.05g/kg。酸性橙为违禁添加色素。尽管如此，有些商家为了牟取暴利、降低成本，私自滥用合成色素的现象时有发生。例如，大家熟知的“苏丹红鸡蛋”、“染色馒头”等食品安全事件就是很好的说明。

目前，检测合成色素的方法主要有高效液相色谱法、薄层色谱法、分光光度法等。它们当中有些需要大型昂贵的仪器，且操作复杂、需要专业的操作人员；有些灵敏度不够高、数据处理方法复杂，均不适合合成色素的现场、快速、高灵敏检测。表面增强拉曼光谱技术(surfaceenhancedramanscattering，sers)作为一种新兴的指纹光谱式检测技术，具有灵敏度高、特异性好、检测快速、操作简便且可实现无损检测的特点，是现有快检方法中最有可能实现“傻瓜式”检测的技术之一，在食品安全快检领域越来越受到重视。近年来，基于sers技术发展了多种合成色素的检测方法。例如，采用sers法实现饮料中碱性嫩黄o的检测。尽管以上方法成功实现了合成色素的现场、简单、快速、高灵敏检测，但其合成的拉曼增强材料均一性不好，而且忽视了sers用于定量时普遍存在的问题——增强基底的不均匀性以及体系中不明干扰物都会对sers检测结果的重复性产生很大的影响，进而影响结果的准确性。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述sers检测结果的缺陷，提供一种拉曼增强纳米材料及其制备方法和应用，上述拉曼增强纳米材料的稳定性好、均一性好、增强效果好，采用表面增强拉曼光谱内标法检测时，有效解决了因体系中其它物质干扰、增强基底不均一等原因造成的拉曼结果重复性差的问题。

为了实现上述目的，在基础的实施方案中，本发明一方面提供一种拉曼增强纳米材料，包括内核，在内核上修饰的内标分子以及在修饰有内标分子的内核表面包裹的壳层，所述内核为球形纳米金，所述内标分子为甲酚紫(cva)，所述壳层为金属银壳层。

在一种优选的实施方案中，所述纳米材料的粒径为30～80nm。

本发明另一方面提供了上述纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

s1、采用晶种增长法合成胶体稳定性好、粒径均一的球形纳米金；

s2、在所述球形纳米金表面修饰充当内标的拉曼信号分子cva，在修饰有cva的纳米金

表面进一步包裹ag壳，合成出au-cva@ag纳米材料。

在一种优选的实施方案中，所述步骤s1的晶种增长法合成球形纳米金，包括：

(1)将稀释后的haucl4·3h2o溶液剧烈搅拌，加热至沸腾后，快速加入柠檬酸钠-

柠檬酸混合溶液，继续加热搅拌，合成得到晶种溶液，冷却至室温备用；

(2)取步骤(1)合成的晶种溶液稀释后，在室温下剧烈搅拌，将a液和b液采用蠕动泵缓慢加入晶种溶液中；之后加热至沸腾，继续搅拌，得到第一步增长溶液，冷却至室温；其中：a液为haucl4·3h2o的稀释溶液，稀释前a液的w/v为0.2％，b液为抗坏血酸和柠檬酸钠混合溶液的稀释溶液，稀释前b液的w/v为1％；

(3)取步骤(2)合成的第一步增长溶液稀释后，室温下剧烈搅拌，将a液和b液采用蠕动泵分别同时缓慢加入第一步增长溶液中；之后加热至沸腾，继续搅拌，合成得到纳米金；冷却至室温备用；其中a液为haucl4·3h2o的稀释溶液，稀释前a液的w/v为0.2％，b液为抗坏血酸和柠檬酸钠混合溶液的稀释溶液，稀释前b液的w/v为1％。

在一种优选的实施方案中，上述步骤(2)-(3)中，所述w/v为0.2％的haucl4·3h2o溶液、w/v为1％的抗坏血酸溶液与w/v为1％的柠檬酸钠溶液的体积比为8:2:1。

在一种优选的实施方案中，上述步骤(2)-(3)中，所述蠕动泵的参数设置为2.5～3.0。

在一种优选的实施方案中，所述步骤s2中由所述纳米金合成得到au-cva@ag纳米材料，具体包括：

在所述纳米金中加入cva溶液，室温过夜静置或温和振荡后，离心重悬到超纯水中，得到au-cva溶液；在搅拌状态下，依次加入柠檬酸钠溶液、抗坏血酸溶液，然后逐滴缓慢加入硝酸银溶液，待溶液加完后继续搅拌，所得产物冰箱4℃保存备用。

在一种优选的实施方案中，所述cva溶液的浓度为1.0mm，柠檬酸钠溶液的质量分数为0.1％～1％，抗坏血酸和硝酸银的浓度分别为17.6mg/ml和1.69mg/ml。

在一种优选的实施方案中，所述cva溶液的体积为0.5～10μl，柠檬酸钠溶液、抗坏血酸溶液以及硝酸银溶液的体积分别为200μl，50μl，50～600μl。

在一种优选的实施方案中，所述步骤s2中由所述纳米金合成得到au-cva@ag纳米材料，具体包括：

在所述纳米金中加入cva溶液，室温过夜静置或温和振荡后，离心重悬到超纯水中，得到au-cva溶液；在搅拌状态下，在au-cva溶液中依次加入柠檬酸三钠、抗坏血酸、硝酸银、氢氧化钠，待溶液加完后室温继续搅拌，最后离心、重悬到等体积超纯水中，4℃保存备用。

在一种优选的实施方案中，所述cva溶液的浓度和体积分别为1.0mm和0.5～10μl，硝酸银溶液的浓度和体积分别为16.9mg/ml和15～60μl，氢氧化钠溶液的浓度和体积分别为4mg/ml和50～150μl。

本发明另一方面提供了上述纳米材料的应用，将其应用于表面增强拉曼光谱内标法中检测食品合成色素。

在一种优选的实施方案中，所述食品合成色素选自孟加拉玫瑰红、柯衣定、赤藓红、罗丹明b和罗丹明g。

在一种优选的实施方案中，所述表面增强拉曼光谱内标法检测食品合成色素的方法，包括：

a1、将au-cva@ag纳米材料、助凝剂以及已知浓度的待测色素标准溶液置于容器中室温混合，得到混合物，反应1～2min，采用便携式拉曼光谱仪直接进行拉曼测试，以待测合成色素某一明显特征峰峰强与cva在591cm^-1处峰强的比值为纵坐标，待测合成色素的浓度为横坐标，绘制定量分析标准工作曲线；

a2、将待测未知浓度的色素样品与au-cva@ag纳米材料、助凝剂室温混合，反应1～2min；借助便携式拉曼光谱仪，检测混合物中待测色素某一明显特征峰峰强与cva在591cm^-1处峰强的比值，将其代入步骤a1获得的标准工作曲线中，从而得出样品中待测色素的准确含量。

在一种优选的实施方案中，所述助凝剂为含有40mmkbr的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，所述柠檬酸-柠檬酸钠溶液的浓度为0.1m，ph为3.0～4.0；或者所述助凝剂为w/v为4.4％的甲酸溶液与0.1～0.5m的氢氧化钠的混合溶液。

在一种优选的实施方案中，所述步骤a1和a2中拉曼测试时，混合物的组成为200～300μlau-cva@ag纳米材料溶液、50～100μl助凝剂、200μl待测色素溶液。

在一种优选的实施方案中，所述步骤a1和a2中拉曼测试时，仪器测试条件为：激光波长为785nm，曝光时间为5～20s，积分次数为3次，取平均值，激光功率为300mw。

通过上述技术方案，本发明纳米材料中球形纳米金为银壳的包裹提供模板，同时将内标分子cva(拉曼谱峰相对纯净，只在591cm^-1处有明显特征峰，与待测物的谱峰重叠几率很小、好辨别)修饰在纳米金和银壳之间，不仅可以增大cva的拉曼信号，而且有了银壳的保护使其免受实际样测试时体系环境的影响；而在最外面的银壳有了纳米金的支撑作用，不仅稳定性大大提高，而且可用于直接增强合成色素等物质的拉曼信号。

同时，本发明采用晶种增长-蠕动泵缓慢加样法合成纳米金，所得产物不仅分散性良好，粒径均一，呈规则球形，而且胶体稳定性好，4℃可以保存半年，这为合成稳定性好、增强效果好的au-cva@ag纳米材料奠定了良好的基础；本发明采用表面增强拉曼光谱内标法检测食品合成色素，不仅充分发挥了拉曼光谱的指纹特征性，而且增强基底中内标分子cva的使用，有效解决了因体系中其它物质干扰、增强基底不均一等原因造成的拉曼结果重复性差的问题，进而有效保证了待测物定量的准确性；另外，本发明方法的整个构建过程和检测过程不需要大型仪器、昂贵的试剂以及有机试剂，而且检测时只需将待测样与au-cva@ag纳米材料、助凝剂室温混合1～2min，完全可以满足基层以及偏远地区食品合成色素的现场、简单、快速、安全、高灵敏检测。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的纳米金的tem图。

图2(a)为本发明实施例1的ag-cva@ag纳米材料合成过程的uv-vis表征图；图2(b)为本发明实施例1表面增强拉曼光谱内标法检测孟加拉玫瑰红的可行性拉曼测试图。

图3为本发明实施例1通过表面增强拉曼光谱内标法检测不同浓度孟加拉玫瑰红的拉曼测试图(3a)以及对应的工作曲线图(3b)。

图4为本发明实施例2通过表面增强拉曼光谱内标法检测罗丹明b的可行性拉曼测试图(4a)以及灵敏度实验图(4b)。

具体实施方式

为了更好的理解上述技术方案，下面通过具体实施例对本申请技术方案做详细的说明，应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互结合。应当理解的是，这里所使用的术语“和/或”包括其中一个或更多所列出的相关联项目的任意和所有组合。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。实施例中所用的材料可通过市售渠道获得。

实施例1

本发明实施例au-cva@ag纳米材料的合成方法包括如下步骤：

(1)晶种的合成：将2.5mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液稀释至50ml，加入圆底烧瓶中；剧烈搅拌，加热至沸腾后，快速加入2ml柠檬酸钠-柠檬酸混合溶液(其w/v分别为1％和0.05％)。继续加热搅拌5min，冷却至室温备用。

(2)第一步增长：取3ml步骤(1)合成的晶种溶液稀释至20ml，加入圆底烧瓶中，室温下剧烈搅拌，将a液和b液采用蠕动泵同时缓慢加入烧瓶中(蠕动泵参数设置为2.5～3.0)；之后在油浴条件下加热至沸腾，继续搅拌30min，最后冷却至室温。其中a液为2mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液稀释至10ml超纯水中，b液为0.5ml抗坏血酸和0.25ml柠檬酸钠(其w/v均为1％)混合溶液稀释至10ml超纯水中。

(3)纳米金的合成：取4.5ml步骤(2)合成的第一步增长溶液稀释至20ml，室温下剧烈搅拌，将a液和b液分别同时缓慢加入烧瓶中(蠕动泵参数设置为2.5～3.0)；之后在油浴中加热至沸腾，继续搅拌30min，最后冷却至室温备用。其中a液为1mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液稀释至10ml超纯水中，b液为0.25ml抗坏血酸和0.125ml柠檬酸钠(其w/v均为1％)混合溶液稀释至10ml超纯水中。

(4)au-cva@ag纳米材料的合成：在6ml纳米金中加入3μl1.0mmcva溶液，室温过夜静置或温和振荡后，离心重悬到5ml超纯水中；接着，快速搅拌下，依次加入200μl1％柠檬酸钠溶液、50μl17.6mg/ml抗坏血酸溶液，然后逐滴缓慢加入200μl1.69mg/ml硝酸银溶液，待溶液加完后继续搅拌20～30min，所得产物冰箱4℃保存备用。

采用本发明实施例制备的au-cva@ag纳米材料，通过表面增强拉曼光谱内标法检测孟加拉玫瑰红，包括如下步骤：

s1：孟加拉玫瑰红标准溶液的检测：在2ml玻璃管中依次加入300μl步骤(4)合成的au-cva@ag纳米材料、50μl甲酸溶液(w/v为4.4％)与氢氧化钠(0.1m)的混合溶液、200μl不同浓度的孟加拉玫瑰红标准品溶液(50，100，200，500，1000ppb)，混合2min后在便携式拉曼光谱仪上进行拉曼测试。测试条件为：激光波长为785nm，曝光时间为10s，积分次数为3次，取平均值，激光功率为300mw。记录不同浓度下，混合溶液在591cm^-1与1325cm^-1处的拉曼峰强度。

首先，将合成的纳米金进行tem表征，结果见图1。从中可以看出，纳米金分散性良好，呈规则球形，粒径均一，约为75nm。其次，对au-cva@ag纳米材料的合成过程进行了uv-vis表征。如图2(a)所示，纳米金表面修饰上cva后，最大吸收峰由546nm稍红移至547.6nm，进一步包裹银壳后，在419nm和535nm处分别出现银和金的吸收峰，表明银壳已成功包裹在纳米金表面。接着，分别测试了au@ag与甲酚紫的混合溶液；au@ag、助凝剂与孟加拉玫瑰红的混合溶液；au-cva@ag、助凝剂与孟加拉玫瑰红的混合溶液的拉曼图。从图2(b)可以看出，第三组混合溶液同时出现了cva和孟加拉玫瑰红的拉曼谱峰，且后者的拉曼峰很明显。该结果表明，合成的au-cva@ag纳米材料可用于孟加拉玫瑰红的内标法定量。然后，我们对不同浓度孟加拉玫瑰红进行了灵敏度实验，结果见图3(a)。从中可以看出，当孟加拉玫瑰红的浓度低至50ppb时，其拉曼谱峰仍明显可见，表明本方法可检测低至50ppb的孟加拉玫瑰红。通过以孟加拉玫瑰红特征峰1325cm^-1处峰强与cva特征峰591cm^-1处峰强比值为纵坐标，孟加拉玫瑰红浓度为横坐标，获得了如图3(b)所示的标准工作曲线。拟合后，曲线方程为y＝1.5034×10^-4x+0.0193，r²为0.984。检测孟加拉玫瑰红的线性范围为50～1000ppb。

s2：饮料样品中孟加拉玫瑰红的检测：首先将超市购买回来的饮料进行简单的过滤处理；然后取200μl待测液加入300μlau-cva@ag纳米材料、50μl甲酸溶液(w/v为4.4％)-氢氧化钠(0.1m)的混合溶液中，室温混合2min后，进行拉曼测试，记录该溶液在1325cm^-1与591cm^-1处的拉曼峰强度。将两者的峰强比值代入步骤s1获得的工作曲线中，即可算出饮料中孟加拉玫瑰红的浓度。

实施例2

本发明实施例au-cva@ag纳米材料的合成方法包括如下步骤：

(1)晶种的合成：将2.5mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液稀释至50ml，加入圆底烧瓶中；剧烈搅拌，加热至沸腾后，快速加入2ml柠檬酸钠-柠檬酸混合溶液(其w/v分别为1％和0.05％)。继续加热搅拌5min，冷却至室温备用。

(2)第一步增长：取3ml步骤(1)合成的晶种溶液稀释至20ml，加入圆底烧瓶中，室温下剧烈搅拌，将a液和b液采用蠕动泵同时缓慢加入烧瓶中(蠕动泵参数设置为2.5～3.0)；之后在油浴条件下加热至沸腾，继续搅拌30min，最后冷却至室温。其中a液为2mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液稀释至10ml超纯水中，b液为0.5ml抗坏血酸和0.25ml柠檬酸钠(其w/v均为1％)混合溶液稀释至10ml超纯水中。

(3)纳米金的合成：取4.5ml步骤(2)合成的第一步增长溶液稀释至20ml，室温下剧烈搅拌，将a液和b液分别同时缓慢加入烧瓶中(蠕动泵参数设置为2.5～3.0)；之后在油浴中加热至沸腾，继续搅拌30min，最后冷却至室温备用。其中a液为2mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液稀释至10ml超纯水中，b液为0.5ml抗坏血酸和0.25ml柠檬酸钠(其w/v均为1％)混合溶液稀释至10ml超纯水中。

(4)au-cva@ag纳米材料的合成：在10ml纳米金中加入6μl1.0mmcva溶液，室温过夜静置或温和振荡后，离心重悬到10ml去离子水中；接着，室温缓慢搅拌下，在获得的au-cva溶液中依次加入400μl柠檬酸三钠溶液(1.41mg/ml)、180μl抗坏血酸溶液(17.6mg/ml)、45μl硝酸银溶液(16.9mg/ml)、150μl氢氧化钠溶液(4mg/ml)，待溶液加完后室温继续快速搅拌30min，最后离心、重悬到等体积超纯水中，4℃保存备用。

采用本发明实施例制备的au-cva@ag纳米材料，通过表面增强拉曼光谱内标法检测罗丹明b，包括如下的步骤：

罗丹明b标准溶液的检测：在一2ml比色皿中依次加入200μlau-cva@ag纳米材料、100μl40mmkbr的柠檬酸-柠檬酸钠溶液(0.1m，ph＝3.0)、200μl不同浓度的罗丹明b标准溶液(20，50，100，5000ppb)，混合2min后在便携式拉曼光谱仪上进行拉曼测试。测试条件为：激光波长为785nm，曝光时间为10s，积分次数为3次，取平均值，激光功率为300mw。记录不同浓度下，混合溶液在591cm^-1与1358cm^-1(罗丹明b特征峰)处的拉曼强度。

首先，基于本实施例合成的au-cva@ag纳米材料，进行了罗丹明b检测的可行性实验。如图4(a)所示，分别测试了au@ag与罗丹明b的混合溶液；au@ag、助凝剂与罗丹明b的混合溶液；au-cva@ag、助凝剂与罗丹明b的混合溶液的拉曼图。从中可以看出，第三组混合溶液同时出现了cva和罗丹明b的拉曼谱峰，且后者的拉曼峰很明显。该结果表明，合成的au-cva@ag纳米材料可用于罗丹明b的内标法定量。接着，基于au-cva@ag纳米材料测试了不同浓度罗丹明b的拉曼图，结果见图4(b)。从中可以看出，随着罗丹明b浓度的增加，其在1358cm^-1处的拉曼峰强逐渐增强，当其浓度为5000ppb时，反而有所下降。该结果表明，au-cva@ag纳米材料可用于罗丹明b的内标法检测，且浓度高至5000ppb时，已达饱和，峰强不再增加。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。