一种小儿化积颗粒的检测方法与流程

本发明属于医药质量检测
技术领域：
，具体涉及小儿化积颗粒的检测方法。
背景技术：
：小儿化积颗粒的处方由焦山楂、炒麦芽、六神曲(麸炒)、炒槟榔、炒鸡内金、炒牵牛子六味药材组成，其目前未纳入2015版中国药典。中国发明申请文献cn101229329a公开了一种中成药化积片及其生产工艺，其为化积散的处方：166.67g焦山楂、166.67g炒麦芽、166.67g六神曲(麸炒)、166.67g炒槟榔、166.67g炒鸡内金、166.67g炒牵牛子，主要用于治疗小儿脾胃不和、停食停乳、积聚痞块、肚腹膨胀、四肢倦怠、面色萎黄、不思饮食等症。但是小儿化积相关制剂的检测方法在2015版药典一部中并未记载，小儿化食相关制剂的鉴别方法在2015版中国药典一部中有记载，其中，牵牛子和山楂的薄层色谱鉴别方法具体为：(1)小儿化食口服液中牵牛子鉴别：取本品25ml，加盐酸调节ph值至加乙酸乙酯振摇提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取牵牛子对照药材0.5g，加水煎煮1小时，放冷，滤过，滤液加盐酸调节ph值至同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙醚-三氯甲烷-甲酸(10:50：1)为展开剂，展开，取出，瞭干，在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。(2)小儿化食丸中山楂鉴别：取本品3g，剪碎，加桂藻土1g，研勻，加乙醚20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取山楂对照药材1g，加乙醚15ml，同法制成对照药材溶液。再取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液与对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(20：5:8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热10分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。但是，上述牵牛子和山楂的薄层色谱鉴别方法并不适用于小儿化积颗粒，这是由于小儿化积颗粒与小儿化食口服液、小儿化食丸为不同的剂型，在处方和制法上均有一定差别，因此需要按照不同方法进行检测。小儿化积颗粒剂具有服用、携带、贮藏、运输方便，载药量较大的优点，值得进一步提高质量标准，提高产品质量可控性，因此，本发明对现有的检测方法进行了改进，可以排除干扰，使得到的结果准确。技术实现要素：本发明的目的在于提供了一种简单、专属性强且重复性好的小儿化积颗粒的检测方法，为保障小儿化积颗粒的质量可靠提供了有效途径。一种小儿化积颗粒的检测方法，所述小儿化积颗粒由以下处方制得：焦山楂、炒麦芽、六神曲、炒槟榔、炒鸡内金、炒牵牛子，包括如下步骤：(一)采用薄层色谱法对小儿化积颗粒中山楂和牵牛子进行定性鉴别；(二)采用高效液相色谱法对小儿化积颗粒中的活性成分槟榔碱进行定量鉴别；(三)采用电位滴定法对小儿化积颗粒中活性成分枸橼酸进行定量鉴别。本发明的小儿化积颗粒由焦山楂、炒槟榔、炒麦芽、炒牵牛子、炒鸡内金、六神曲(麸炒)6味药材组成，行消积导滞之功，其中，山楂为常用中药，有消食化滞，行气散瘀的功效，消导作用的有效成分主要是有机酸。现代药理研究认为有机酸具有消食开胃的作用，但山楂生品中有机酸含量较高，在5％～9％之间，对胃肠刺激大，故采用炮制后山楂，炮制后一定程度上降低了山楂中总有机酸的含量，缓和了刺激性；根据中药新药质量标准研究含量测定的选定要求，选择与本品功能主治及适应症相关的主要有效成分作为本品的含量测定指标成分。小儿化积颗粒中定量项为有机酸，有机酸在多种药材中都存在，有一定的缺陷，因此在此基础上增加槟榔碱的定量控制。因此，本发明的检测方法建立了tlc色谱法对焦山楂、炒牵牛子的鉴别项，彩色照片中色谱斑点清晰，阴性无干扰；检查项中各结果均符合规定；含量测定项建立了hplc法测定槟榔碱含量及电位滴定法测定有机酸含量的方法，方法学研究结果均符合要求。所建立的方法简便、准确、重复性好，具有可操作性。步骤(一)中，所述山楂的鉴别方法包括如下步骤：(1)取所述小儿化积颗粒，加乙醇超声处理，蒸去乙醇后加水溶解，再通过聚酰胺柱，先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，残渣加水溶解，用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；(2)取山楂对照药材，加水加热回流，滤液蒸干，残渣加乙醇超声处理，同法制成对照药材溶液；(3)照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液和对照药材溶液点于同一硅胶g薄层板上，利用体积比为2～15∶0.5～10的环己烷-丙酮作为展开剂，展开后取出晾干，喷显色剂，加热置于紫外光灯下检视。本发明小儿化积颗粒的山楂鉴别方法中，实验表明将展开剂换为体积比为2～15∶0.5～10的环己烷-丙酮进行鉴别时，具有很好的重复性及专属性，检测结果更准确。而采用现有小儿化食丸中山楂鉴别法对小儿化积颗粒进行鉴别，通过考察供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显不同颜色的荧光斑点；而在阴性对照色谱中与对照药材色谱相应位置上，有相同颜色的荧光斑点，该方法不具有专属性。优选地，步骤(一)中，所述山楂的鉴别方法包括如下步骤：(1)取所述小儿化积颗粒10g，加30～80％乙醇20～80ml，超声处理20～60min，蒸去乙醇，加水使溶解，通过聚酰胺柱，用水洗脱，弃去，再用30～80％乙醇20～80ml洗脱，收集乙醇洗脱液，残渣加水使溶解，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；(2)取山楂对照药材2g，加水30ml，加热回流1h，滤液蒸干，残渣加30～80％乙醇20～80ml，同法制成对照药材溶液；(3)照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各10μl点于同一硅胶g薄层板上，利用体积比为2～15∶0.5～10的环己烷-丙酮作为展开剂，展开剂先置层析缸内预饱和10～50min，展开后取出晾干，喷10％硫酸乙醇液，105℃加热，置于紫外光灯下检视。在上述优选山楂鉴别方法中，具体限定了鉴别的各步骤，实验表明，在上述特定条件下进行鉴别，不仅对照药材使用量较低，还能使最终薄层色谱斑点分离度较好、更清晰。步骤(一)中，所述牵牛子的鉴别方法包括如下步骤：(1)取所述小儿化积颗粒加甲醇超声处理，滤液蒸干，残渣加水溶解，滤液用稀盐酸调节ph值，再用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；(2)取牵牛子对照药材，加水加热回流，滤液用稀盐酸调节，同法制成对照药材溶液；(3)照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液和对照药材溶液点于同一硅胶g薄层板上，利用体积比为2～15∶1～10∶1～10的乙酸丁酯-甲酸-水上层溶液为展开剂，展开后取出晾干，喷5％三氯化铁乙醇溶液作为显色剂，加热检视。本发明小儿化积颗粒的牵牛子鉴别方法中，实验表明其重复性好且温度和湿度对展开效果无影响，最终得到的薄层色谱斑点明显、清晰，此外，该供试品溶液制备方法简便，对照药材使用量较低，实用性较强，适合大规模应用。而采用现有小儿化食口服液中牵牛子鉴别方法对小儿化积颗粒进行鉴别，发现牵牛子对照药材的特征斑点不清晰，而且供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，相同颜色的斑点清晰度亦不明显，而且易受环境温度的影响展开效果，重复性差。优选地，步骤(一)中，所述牵牛子的鉴别方法包括如下步骤：(1)取所述小儿化积颗粒10g，加甲醇50ml，超声处理40min，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用稀盐酸调节ph值至1～2，再用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；(2)取牵牛子对照药材1g，加水30ml，加热回流40min，滤液用稀盐酸调节ph值至1～2，同法制成对照药材溶液；(3)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10～15μl、对照药材溶液8μl点于同一硅胶g薄层板上，利用体积比为2～15∶1～10∶1～10的乙酸丁酯-甲酸-水上层溶液为展开剂，展开后取出晾干，喷5％三氯化铁乙醇溶液作为显色剂，加热检视。在上述优选牵牛子鉴别方法中，实验表明在上述特定条件下进行鉴别，不仅对照药材使用量较低，还能使最终薄层色谱斑点分离度较好、更清晰。步骤(二)中，所述槟榔碱的高效液相色谱条件为：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以体积比为5～25∶75～95的乙腈-三乙胺溶液为流动相，检测波长为215nm，理论板数按槟榔碱峰计算不低于6000。步骤(二)中，所述槟榔碱的高效液相色谱鉴别方法为：(1)称取氢溴酸槟榔碱对照品，加流动相制成每1ml含氢溴酸槟榔碱30μg的溶液作为对照品溶液；(2)取小儿化积颗粒5g加乙醚50ml，再加碳酸盐缓冲液3ml，放置30分钟，加热回流30分钟，分取乙醚液，残渣再加乙醚加热回流提取2次，合并三次乙醚液，加入磷酸溶液lml，回收乙醚，残渣加50％乙腈溶解，转移至25ml容量瓶中，并稀释至刻度，取续滤液，即得供试品溶液；(3)吸取上述对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定。炒槟榔行气消胀、下气，对乳食停宿肠胃所致的腹部胀满、大便不畅等积滞有推荡行气作用，槟榔碱为槟榔药材的主要有效成分，槟榔碱为m受体激动剂，有较强的促胃肠运动作用，促进胃肠腺体分泌，以增强胃排空为显著，因此选择槟榔碱作为本品质量检测指标成分。利用上述高效液相色谱鉴别方法与鉴别条件相配合测定小儿化积颗粒中槟榔碱的含量，分离效果好、灵敏、准确，保证了本品的质量稳定均一性及疗效。步骤(三)中，所述电位滴定法为：取所述小儿化积颗粒加水摇匀，超声处理后，用0.05mol/l的氢氧化钠滴定液电位滴定ph值至7.0～9.5。本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：(1)本发明利用改进过的薄层色谱法对小儿化积颗粒中山楂、牵牛子进行定性鉴别，得到的薄层色谱鉴别斑点清晰，阴性无干扰，结果较为满意且重复性、稳定性良好；(2)本发明利用高效液相色谱法测定小儿化积颗粒中槟榔碱的含量，该方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点，保证了本品的质量稳定均一性及疗效；(3)本发明利用电位滴定法测定小儿化积颗粒中有机酸的含量，该方法简便、准确、重复性好，具有可操作性；(4)本发明的质量控制方法简单、专属性强、重现性好，有效的保障了小儿化积颗粒的质量和疗效，具有很强的实用性。附图说明图1为本发明山楂鉴别中焦山楂的薄层色谱图，其中1为对照药材、2～4为小儿化积颗粒样品、5为化积片、6为阴性对照样品；图2为本发明牵牛子鉴别中牵牛子的薄层色谱图，其中1为对照药材、2～4为小儿化积颗粒样品、5为化积片、6为阴性对照样品；图3为本发明槟榔碱含量测定中槟榔碱对照品的高效液相色谱图；图4为本发明槟榔碱含量测定中槟榔碱阴性供试品的高效液相色谱图；图5为本发明槟榔碱含量测定中槟榔碱供试品的高效液相色谱图。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明的小儿化积颗粒的检测方法作进一步详细说明。本发明所采用的小儿化积颗粒由海南葫芦娃药业集团有限公司生产，小儿化积颗粒包装规格为一袋3g装。实施例(一)检查对小儿化积颗粒的的粒度、水分、溶化性、装量差异进行测定，再对重金属和砷盐进行了检查，建立了微生物限度检查方法。微生物限度照《中国药典》2015版四部非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)、控制菌检查法(通则1106)，非无菌药品微生物限度标准(通则1107)检查。取本品10g，加ph7.0氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制成1∶10的供试液。取1∶10的供试液1ml，依法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查。取1:10供试液10ml，置100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，依法进行大肠埃希菌检查；取本品10g，置100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，依法进行沙门菌检查。本品每1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，不得检出大肠埃希菌，每10g供试品中，不得检出沙门菌。其他项应符合颗粒剂项下有关的各项规定(《中国药典》2015年版四部通则0104)(二)山楂鉴别(1)称取山楂对照药材2g，加水30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加60％乙醇30ml，同法制成对照药材溶液；(2)称取本品10g，研细，加65％乙醇50ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸去乙醇，加水20ml使溶解，通过已处理好的聚酰胺柱，用水70ml洗脱，弃去水洗液，再用75％乙醇70ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；(3)称取2g焦山楂阴性提取物细粉，按照步骤(2)所述方法操作，作为阴性对照溶液；(4)按照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-丙酮(10∶3)为展开剂，置层析缸内预饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇液，在105℃加热数分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。鉴别结果如图1所示，在供试品色谱中，与对照药材色谱相应位置上，显示出了相同颜色的斑点；在阴性对照色谱中与对照药材色谱相应位置上，无相同颜色的斑点。(三)牵牛子鉴别(1)称取1g牵牛子对照药材，加水30ml，加热回流40分钟，滤过，滤液用稀盐酸调ph值1～2，再用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；(2)称取取本品10g，研细，加甲醇50ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用稀盐酸调ph值1～2，同法制成供试品溶液；(3)称取1.2g炒牵牛子阴性提取物细粉，按照步骤(2)所述方法操作，作为阴性对照溶液；(4)按照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液和阴性供试品溶液各10～15μl，对照药材溶液8μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(10∶2∶1.5)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。鉴别结果如图2所示，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；在阴性对照色谱中与对照药材色谱相应位置上，无相同颜色的斑点。(四)槟榔碱含量测定(1)称取氢溴酸槟榔碱对照品适量，精密称定，加流动相溶解制成浓度为0.3604mg/ml的氢溴酸槟榔碱对照品储备溶液(槟榔碱重量＝氢溴酸槟榔碱重量/1.5214)，槟榔碱对照品储备液浓度为0.2369mg/ml。精密吸取氢溴酸槟榔碱对照品储备溶液1.0ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；(2)取本品，研细，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醚50ml，再加碳酸盐缓冲液(取碳酸钠1.91g和碳酸氢钠0.56g，加水使溶解成100ml，即得)3ml，放置30分钟，时时振摇；加热回流30分钟，分取乙醚液，残渣加乙醚加热回流提取2次(50ml、50ml)，每次15分钟，合并三次乙醚液，加入磷酸溶液(5→1000)lml，混匀，回收乙醚，残渣加50％乙腈溶液溶解，转移至25ml容量瓶中，加50％乙腈至刻度；摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；(3)按本品处方制法，制得缺炒槟榔的阴性颗粒，按步骤(2)所述方法制备得到阴性供试品溶液；(4)分别精密吸取氢溴酸槟榔碱对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定，其中高效液相色谱的条件为：采用dikmadiamonsil-c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈-三乙胺溶液(2→1000，磷酸调节ph值至7.4)(24∶76)为流动相；检测波长为215nm；体积流量1.0ml/min；柱温30℃；氢溴酸槟榔碱对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液色谱图分别如图3～5，结果表明，该色谱条件下，对照品溶液中氢溴酸槟榔碱的色谱峰峰形良好，供试品溶液中氢溴酸槟榔碱相应保留时间处的色谱峰峰形良好，氢溴酸槟榔碱色谱峰与杂质峰的分离度大于1.5，阴性供试品溶液中在氢溴酸槟榔碱色谱峰相应保留时间处无色谱峰出现，该色谱条件专属性良好。(五)枸橼酸定量测定取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，摇匀，密塞，称定重量，超声处理(功率120w，频率40khz)30分钟，取出，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，照电位滴定法，用氢氧化钠滴定液(0.05mol/l)电位滴定至ph8.0，即得。每1ml氢氧化钠滴定液(0.05mol/l)相当于3.202mg的枸橼酸。本品每袋含有机酸以枸橼酸(c6h8o7)计，不得少于15.0mg。阴性供试品溶液的制备按本品处方制法，制得空白辅料颗粒，按供试品的制备方法制备，即得阴性供试品溶液。测定法：照电位滴定法，用0.05mol/l氢氧化钠滴定液电位滴定至ph8.0，即得。每1ml氢氧化钠滴定液(0.05mol/l)相当于3.202mg的枸橼酸。测定结果为：25.98mg/袋。结果表明，滴定中阴性供试品溶液消耗的氢氧化钠滴定液的体积极微，因此，阴性供试品溶液无干扰。上述步骤(四)中，对hplc进行方法学考察，具体分析如下：(1)专属性考察该色谱条件下，对照品溶液中氢溴酸槟榔碱的色谱峰峰形良好，供试品溶液中氢溴酸槟榔碱相应保留时间处的色谱峰峰形良好，氢溴酸槟榔碱色谱峰与杂质峰的分离度大于1.5，阴性供试品溶液中在氢溴酸槟榔碱色谱峰相应保留时间处无色谱峰出现，该色谱条件专属性良好。(2)线性试验考察分别精密吸取上述氢溴酸槟榔碱对照品储备溶液，浓度为0.3604mg/ml(即槟榔碱对照品储备液浓度为0.2369mg/ml)，0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定，分别进样10μl，记录色谱图，读取峰面积，以槟榔碱进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得标准曲线。结果表明，在进样量为0.04738～1.1845μg之间，槟榔碱呈良好的线性关系。回归方程为∶y＝3424.352x–2.5918，相关系数：r＝1.0000。(3)精密度试验取本品，按法制备供试品溶液，连续进样6次，依法测定，记录氢溴酸槟榔碱色谱峰面积，结果见下表1。表1精密度试验数据编号123456平均值供试品峰面积785.886785.498786.005767.332785.367768.631779.786结果表明，供试品中氢溴酸槟榔碱平均峰面积分别为779.8，rsd分别为1.17％，精密度良好。(4)稳定性试验取本品，按法制备供试品溶液和氢溴酸槟榔碱对照品溶液分别于室温放置0、2、4、8、12、24h后分别进样，依法测定，记录氢溴酸槟榔碱色谱峰面积，结果见表2。表2稳定性试验数据结果表明，供试品溶液在室温放置24h内稳定，峰面积rsd为0.47％，对照品溶液在室温放置24h内稳定，峰面积rsd分别为0.35％。(5)重复性试验取本品约5g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，制备6份，依法测定，按外标法计算本品中氢溴酸槟榔碱的含量，结果见表3。表3重复性试验结果样品号123456槟榔碱含量(mg/g)0.20550.20640.20580.20560.20680.2050结果表明，槟榔碱含量平均值分别为0.2059mg/g，rsd为0.32％，重复性良好。(6)加样回收率试验取本品9份，每份约2.5g，精密称定，平行9份，分别置于9个锥形瓶中，各取3份分别精密加入氢溴酸槟榔碱对照品储备溶液，即槟榔碱对照品储备液浓度为0.6ml，1.2ml，1.8ml，加入乙醚50ml，分别再加碳酸盐缓冲液3ml，照含量测定法处理，依法操作，制备9份供试品溶液，进样，测定，计算回收率，结果显示：在80％～120％的浓度范围内，回收率为92.71％～94.36％，rsd为0.43％～2.47％，符合要求。当前第1页12