一种裸花紫珠制剂的检测方法与流程

本发明属于药物检测技术，尤其涉及一种裸花紫珠制剂的检测方法。

背景技术：

如何有效地评价中药质量是中药现代化研究面临的关键问题之一。中药成分复杂，现行的用1～2种化学成分评价中药质量的模式，无法表征中药化学成分的整体性和复杂性，不能有效地评价中药的质量。《中国药典》中运用hplc法对裸花紫珠制剂中木犀草苷和毛蕊花糖苷进行含量测定，但前处理复杂，每种成分需单独配置供试品进行检测，且色谱方法较为繁琐；目前国内外学者也对裸花紫珠制剂的质量控制技术已有一些公开，但关于裸花紫珠制剂中木犀草苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷此三种成分的一测多评方法未见报道。本方法的提出，提高了方法的实用性，可用于裸花紫珠制剂的质量评价，更准确、方便地实现多成分同步测定，更好地控制质量。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对裸花紫珠制剂的检测现状，为有效地控制裸花紫珠制剂的内在质量，缩短检测时间，节约检测成本，提供一种一测多评法，有利于对裸花紫珠制剂产品质量的有效控制及保证其临床疗效。

一种裸花紫珠制剂的检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

分别称取木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加25％～75％乙醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

取裸花紫珠制剂，置锥形瓶或容量瓶中，加25％～75％乙醇，称重，超声或回流处理30～60min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；

(3)hplc检测：

分别吸取步骤(1)和(2)所得的对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定；其中，色谱条件为：色谱柱为c18反相色谱柱；紫外检测器；柱温为30～35℃；检测波长为320～340nm；流动相a为乙腈，流动相b为0.1～0.5％磷酸溶液，流速为0.8～1.2ml/min；分析时间25分钟；等度洗脱，流动相a:流动相b＝18～20:82～80；

(4)相对校正因子的确定

以木犀草苷为内标物，分别计算毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的相对校正因子(rcf)值；(5)色谱峰定位参数的确定

以木犀草为对照品，对毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的色谱峰的位置进行测定，达到一测多评目的。

所述步骤(1)对照品溶液的制备优选下述方法进行：

分别称取木犀草苷对照品11.70mg、毛蕊花糖苷对照品23.15mg、异毛蕊花糖苷对照品26.75mg，置于容量瓶中，加25％～75％乙醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

所述步骤(2)供试品溶液的制备优选下述方法进行：

a、裸花紫珠制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂：取裸花紫珠制剂内容物，研细，称取0.1～3g，置锥形瓶中，加25％～75％乙醇，称重，超声或回流处理30～60min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；

b、裸花紫珠制剂为合剂、口服液：取裸花紫珠制剂混匀，精密量取5～10ml，置25～100ml容量瓶中，加25％～75％乙醇，超声或回流处理30～60min，放冷，用同种溶剂稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液。

所述步骤(1)和(2)中乙醇浓度优选为50％。

所述步骤(2)中超声处理时间优选45分钟。

所述步骤(3)中的色谱柱优选柱长为250mm的c18反相色谱柱。

所述步骤(3)中检测波长优选325nm。

所述步骤(3)中流动相b优选0.1％磷酸溶液。

所述步骤(3)中流速优选1.0ml/min。

所述步骤(3)中流动相a：流动相b的体积比优选18.8:81.2。

本发明的有益效果：(1)从含量上阐明有效成分间的相互关系，实现在对照品短缺的情况下，多指标成分的含量测定；(2)一测多评方法建立的校正因子，提高方法的适用性，更准确方便的实现该制剂的质量控制；(3)缩短检测时间，节约检测成本.

附图说明

图1为检测波长3d图；

图2为三种标准品的hplc色谱图(木犀草苷)；

图3为三种标准品的hplc色谱图(毛蕊花糖苷)；

图4为三种标准品的hplc色谱图(异毛蕊花糖苷)；

图5为裸花紫珠片hplc色谱图；

具体实施方式

实施例1一种裸花紫珠片剂的检测方法

1仪器与材料

1.1药品与试剂

对照品木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷。裸花紫珠片：0.5g/片，批号分别为161980、161990、162020、170040、170050、170080、172010，由海南九芝堂药业有限公司提供。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2仪器

agilent1200高效液相色谱仪(美国agilent公司)；shimadazulc-10at高效液相色谱仪(日本岛津公司)；kq3200de型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；milli-q纯水系统(美国millipore公司)；bs110s电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；zorbaxsbc-18分析柱(4.6mm×250mm，5μm，美国agilent公司)；elite分析柱；dikma分析柱。

2方法与结果

2.1波长筛选、流动相选择、提取方法与时间选择

采用spd-m20a检测器对样品进行了全波长扫描(见图1)，根据3d效果图，综合峰形、峰高、峰面积等因素，选择325nm为检测波长。

考察了不同比例的水-乙腈，乙腈-磷酸溶液等流动相对样品的洗脱效果，综合考虑图谱分离度、柱效、对称因子等结果，最后选择乙腈-0.1％磷酸为流动相。又根据样品的检测结果(见图2至图3)，发现木犀草苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷三种成分色谱峰在检测25min之内全部出峰，从而确定检测时间为25min。

称取裸花紫珠片0.5g，分别用甲醇，25％乙醇，50％乙醇，75％乙醇，无水乙醇超声提取。通过检测结果发现，50％乙醇为溶剂提取，三个指标性成分总体含量比较大，因此选择50％乙醇为提取溶剂。随后考察料液比1:50、1:100、1:150和1:200时50％乙醇超声提取的效果，结果表明，料液比为1:100时提取较完全。最后考察不同提取方法和提取时间对提取效果的影响，分别采用超声和回流方式，时间为30min，45min，60min，结果显示超声45min最佳。

通过对提取溶剂、方法、体积、时间考察，最终确定选择50％乙醇50ml超声提取45min为片剂提取方法。

表1提取溶剂结果比较表

表2料液比考察结果比较表

表3提取方法与时间选择结果比较表

2.2色谱条件

通过考察检测器、流动相体系、色谱柱、柱温和流速等条件，经过反复优化，得到裸花紫珠指纹图谱的最佳色谱条件为：紫外检测器，流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)＝18.8:81.2，等度洗脱，agilentzorbaxsb-c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl，检测波长325nm，检测时间：25min。

2.3供试品溶液制备

取本品10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称重，超声处理(功率100w，频率40khz)45分钟，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，取续滤液备用。

2.4对照品溶液制备

精密称取量木犀草苷11.70mg、毛蕊花糖苷23.15mg、异毛蕊花糖苷26.75mg对照品，用50％乙醇分别溶解于3个25ml的容量瓶中，超声处理使其充分溶解，并用50％乙醇定容制成储备液。

2.5线性关系考察

分别精密吸取木犀草苷(浓度为：0.468mg/ml)、毛蕊花糖苷(浓度为：0.926mg/ml)、异毛蕊花糖苷(浓度为：1.070mg/ml)各2，4，6，8，10μl，注入高效液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明：木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品分别在0.936～4.680μg，1.852～9.260μg，2.140～10.700μg范围内线性关系良好，回归方程分别为：y＝1583.6x+244.66，r＝0.9992；y＝1792.7x+155.43，r＝0.9991；y＝2065.6x+279.49，r＝0.9993。结果见表4。由表4可看出，该方法测得的各个成分线性良好。

表4对照品回归方程、相关系数、线性范围

2.6方法学考察

2.6.1精密度试验

取3种对照品溶液，分别连续进样6次，测定峰面积。计算得木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷峰面积的rsd分别为0.77％、2.03％、1.58％，表明仪器精密度良好。

2.6.2重复性

取同一供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、12、24h后进样，计算得木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的峰面积rsd分别为0.16％、0.54％、1.72％，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.6.3稳定性实验

取批号为161980样品，分别制备6份，进行测定，计算得木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷rsd％分别为1.25％、1.79％、1.03％，表明本法重复性良好。

表5方法学考察结果

2.7加样回收试验

精密称取已知含量的161980供试品6份(木犀草苷含量为0.53％，毛蕊花糖苷含量为3.22％，异毛蕊花糖苷含量为5.91％)，分别精密加入一定量的木犀草苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对照品，照供试品溶液制备方法制备样品溶液，依法测定，并计算回收率，结果见表6。

表6方法回收率试验结果(n＝6)

2.8不同高效液相色谱仪和色谱柱的相对校正因子(rcf)重现性考察

精密吸取各对照品溶液，分别进样10μl，平行重复6次，以木犀草苷为内标物，分别计算毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的rcf值，取均值。试验考察了agilent1200型和shimadazulc-10at型两种高效液相色谱仪和zorbaxsbc-18(4.6mm×250mm，5μm)、elitec18(4.6×250mm，5μm)、dikmac18(4.6×250mm，5μm)三种色谱柱，结果表明不同高效液相色谱仪和色谱柱对各成分的rcf值影响不大，具体结果见表7。

表7不同仪器和色谱柱测定rcf值(n＝6)

2.9色谱峰定位参数考察

由于本实验使用木犀草苷作为对照品，需要对毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的色谱峰的位置进行定位，进而达到一测多评的目的。故利用相对保留时间(tk/s)，即待测组分(tk)和内标物的保留时间(ts)之比：tk/s＝tk/ts，就能定位待测组分。结果见表8。

表8不同仪器和色谱柱的tk/s值(n＝6)

实验测得木犀草苷对毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的相对保留时间(tk/s)的平均值分别为1.082和1.459。rsd分别为0.71％和1.65％之间。表明利用tk/s进行各色谱峰的定位是可行的。2.10样品测定

分别精密吸取各供试品溶液10μl，进样测定。分别采用外标法和一测多评法计算木犀草苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量，结果无显著差异。具体数据见表9。

表9本发明一测多评法与外标法的结果比较(mg·g^-1、n＝3)

实施例2一种裸花紫珠栓剂的一测多评法

1.1药品与试剂

对照品木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷。裸花紫珠栓：1.4g/粒，批号分别为140021、140031、160201，由海南九芝堂药业有限公司提供。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2仪器

agilent1200高效液相色谱仪(美国agilent公司)；shimadazulc-10at高效液相色谱仪(日本岛津公司)；kq3200de型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；milli-q纯水系统(美国millipore公司)；bs110s电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；zorbaxsbc-18分析柱(4.6mm×250mm，5μm，美国agilent公司)。

2方法与结果

2.1供试品溶液制备

取重量差异项下的本品，剪碎，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率100w，频率40khz)45分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2对照品溶液制备

精密称取量木犀草苷11.70mg、毛蕊花糖苷23.15mg、异毛蕊花糖苷26.75mg对照品，用50％乙醇分别溶解于3个25ml的容量瓶中，超声处理使其充分溶解，并用50％乙醇定容制成储备液。

2.3样品测定