一种β-羟丁酸电化学传感器的制作方法

本实用新型属于医疗设备技术领域，具体涉及一种用于全血酮体检测设备中的β-羟丁酸电化学传感器。

背景技术：

酮体是脂肪酸分解代谢的产物，包括三种成分：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮，其中β-羟丁酸是主要成分，约占酮体总量的78％。肝脏生成酮体，肝外组织能利用酮体作为能量来源，在正常情况下血中仅含少量酮体，但在某些情况下如碳水化合物代谢发生障碍，机体脂肪动员增强，肝脏生成酮体量超过肝外组织利用酮体的能力，引起血中酮体的堆积，可导致酮症酸中毒，因此及时检测血中β-羟丁酸的浓度极为重要。

根据2017年国际糖尿病协会(IDF)发布的第八版全球糖尿病概览，数据显示全球每11位成人中就有1位糖尿病患者，我国糖尿病患者人数达到1.144亿，居全球第一。糖尿病酮症酸中毒(DKA)是一种常见的糖尿病急性并发症。美国糖尿病协会(ADA)建议糖尿病患者在急性疾病、应激反应、怀孕和血糖水平持续超过13.4mmol/L时都应检查血中β-羟丁酸浓度。因此，建立一种简便快速的方法用来检测β-羟丁酸的浓度，对临床中酮症的预防、诊断以及监测有着重要的意义。

近年来，通过丝网印刷技术制备的一次性电化学传感器在即时检测(POCT)领域得到广泛应用。POCT的含义可从两方面进行理解：空间上，在患者身边进行的检测，即"床旁检测"；时间上，可快速得到检测结果，即"即时检测"。POCT的主要特点是快速检测、操作简便、小型便携、结果稳定、具有可比性等等。患者在家中利用一次性生物传感器进行检测，就可获得患者当时的分析物浓度，帮助患者及时了解自身的身体状况并据此调整自己的饮食结构，或到医院让医生根据日常监控的数据对用药剂量进行调整。因此在疾病日常监控中这类一次性生物传感器的准确度显得尤为重要，同时必须易于批量生产，价格低廉。

专利CN101900734B公开了一种采用显色法检测β-羟丁酸浓度的半定量诊断试纸。专利CN102435749B公开了一种循环酶法测定β-羟丁酸浓度的液体试剂盒，检测主波长505nm。专利CN104730230B公开了一种β-羟丁酸酶法检测试剂盒，检测主波长340nm。专利CN2788184Y公开了一种电化学法的β-羟丁酸生物检测试条，反应区的反应试剂包括：β-羟丁酸脱氢酶≥1.2IU，硫辛酰胺脱氢酶≥1U，铁氰化钾：0.1mg，其它盐类：64％。专利CN102636539A公开了一种检测β-羟丁酸电化学试纸，试剂酶层包括羟丁酸脱氢酶，还原性辅酶，铁氰化钾，壳聚糖等。

以上技术路线中，利用光学法的检测试剂盒准确定量β-羟丁酸适用于生化分析仪，难以满足便携式POCT产品的需求。此外，β-羟丁酸的正常生理浓度低于0.6mmol/L(即7.56mg/dL)，超过该浓度即有酮症酸中毒的倾向，因此要求检测试剂盒有较低的线性下限，从而保证极低浓度检测结果的准确性。此外，本领域研究者易知，随着电化学传感器有效日期临近，干式试剂的试剂层中组分的物理和化学变化(比如酶活的逐步丧失，电子介体铁氰化钾被还原等)均会导致电化学传感器的准确度劣化。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本实用新型的目的在于提供一种β-羟丁酸电化学传感器，其具有结构设计合理、试剂配伍优化、检测准确度高的优点。

本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种β-羟丁酸电化学传感器，包括：基片层(1)，前端留有半圆形的进样缺口(11)；位于所述基片层(1)上的电极层(2)，所述电极层(2)包括工作电极(21)和对电极(22)以及开机电极(23)和导线(24)；

位于所述电极层(2)上的绝缘层(3)，所述绝缘层(3)处开有试剂窗口(31)，暴露工作电极(21)和对电极(22)的工作部分；试剂窗口(31)用以限定反应试剂，液体的反应试剂滴在这个区域，限定意味着能使得液体反应试剂难以溢出区域之外；

粘贴于所述绝缘层(3)上的中隔层(4)，所述中隔层(4)留有亲水窗口(41)和排气窗口(42)；

亲水窗口(41)和排气窗口(42)以及试剂窗口(31)构成进样空间。

进一步地，所述进样缺口(11)的形状为弧形，进样缺口(11)设置在基片层(1)上对应于所述工作电极(21)和对电极(22)的一端。

进一步地，所述亲水窗口(41)和排气窗口(42)、试剂窗口(31)和进样缺口(11)构成血液样本进样的容纳空间。

进一步地，所述中隔层(4)上附有压敏胶，使得中隔层(4)粘贴于绝缘层(3)之上；所述亲水窗口(41)为经过亲水处理的PET，并没有压敏胶；所述排气窗口(42)敞开设置与外界空气贯通。

进一步地，所述基片层(1)材质为聚对苯二甲酸二乙酯；所述工作电极(21)和对电极(22)的材质为碳；所述开机电极(23)和导线(24)的材质为银；所述绝缘层(3)的材质为疏水性材料；所述中隔层(4)为聚丙烯酸单面胶。

进一步地，位于试剂窗口(31)上的反应试剂包括:(a)酶；(b)酶保护剂；(c)电子介体组合物；(d)缓冲溶液；(e)至少一种表面活性剂；(f)至少一种纤维素类高聚物。

所述酶包括β-羟丁酸脱氢酶，心肌黄酶，辅酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。

本领域普通技术人员易知的酶保护定剂有：糖类，比如海藻糖；多元醇类，比如山梨醇；氨基酸类，比如谷氨酸钠；蛋白类，比如丝蛋白。优选的，所述酶保护剂为糖类，采用海藻糖。

在本实用新型背景下应用的电子介体是本领域熟知的，所述电子介体组合物包括氯化六氨合钌和吩嗪，吩嗪为5-甲基吩嗪硫酸甲酯、5-乙基吩嗪硫酸乙酯、1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯中的一种或多种；优选的，所述电子介体组合物是氯化六氨合钌和1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯。

所述缓冲溶液选自生物缓冲液或两性离子缓冲溶液；优选的，采用Good's缓冲溶液、有机酸缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液；更优选的，所述缓冲溶液为ACES、TES、MES中的一种或多种。

所述反应试剂还包括至少一种表面活性剂，可以是非离子表面活性剂，优选的，采用X-100。X-100导致在点液后液态的反应试剂均匀地配置铺展在电极表面，同时改善干燥的反应试剂的亲水性，从而提高β-羟丁酸电化学传感器在检测血液样本时的进样速率。

所述反应试剂还包括至少一种纤维素类高聚物，优选的，是羟甲基纤维素。高聚物在反应试剂中发挥支架的作用，有助于酶的分散和稳定，同时使得干燥的反应试剂成膜良好，附着力强。

具体的，本实用新型的一种β-羟丁酸电化学传感器的反应试剂包括：β-羟丁酸脱氢酶的浓度为0.5-5wt.％(以酶活性为200u/mg计)，心肌黄酶的浓度为0.5-5wt.％(以酶活性为200u/mg计)，辅酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的浓度为0.5-5wt.％,海藻糖0.1-1wt.％，氯化六氨合钌的浓度为0.5-5wt.％，1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯的浓度为0.005-0.05wt.％，TES缓冲溶液(缓冲溶液中TES的浓度为0.1-1M，pH为6.5-7.5)的浓度为10-50wt.％，X-100的浓度为0.3-3wt.％，羟甲基纤维素的浓度为0.25-2.5wt.％。

一种β-羟丁酸电化学传感器的制备方法，具体如下：

在聚对苯二甲酸二乙酯(PET)材质的基片层上以丝网印刷的方式依次用碳油墨印刷工作电极和对电极，用银油墨印刷开机电极和导线；采用疏水性材料的绝缘油墨印制绝缘层。依据上述反应试剂组成配置出液态的反应试剂，充分搅拌使其溶解分散，形成均匀的溶液；然后通过点液的方式将上述液态的反应试剂配置到绝缘层中的试剂窗口上；再除去液态的反应试剂中的溶剂，从而得到干燥的厚度均一的试剂层；最后粘贴中隔层，从而最终得到一种β-羟丁酸电化学传感器的成品。

本实用新型的β-羟丁酸电化学传感器的测试方法如下：

通过毛细作用吸取血液样本完成后，在工作电极和对电极之间施加300mv的工作电压，采用计时电流法，在10s时获取血液样本的电流值，然后通过校准方程换算成血液样本的β-羟丁酸浓度值。

本实用新型的有益效果如下：

1、本实用新型的一种β-羟丁酸电化学传感器的结构设计合理，通过绝缘层留有窗口限定反应试剂，使得试剂层覆盖均匀，检测时排气通畅，进样快速，有利于提高β-羟丁酸电化学传感器的准确度和精密度。

2、本实用新型的一种β-羟丁酸电化学传感器中的反应试剂配伍合理，热稳定性好，有效避免了随着有效日期临近，传感器的准确度劣化，从而保证了检测结果，尤其是极低浓度样本(实施例中提及可检测0-3mg/dL的β-羟丁酸浓度的血液样本，低于背景技术中常规检测的检测下限7.56mg/dL)的检测结果的准确性，所以实用性更强。

3、本实用新型的一种β-羟丁酸电化学传感器的结构合理，工艺简单，反应试剂原料易得，成本低，有利于工业化生产。

4、本实用新型的一种β-羟丁酸电化学传感器的检测时间短，5-20s即可获取数据，可以完成即时检测的目的。

附图说明

图1是本实用新型的β-羟丁酸电化学传感器的结构示意图；

图2是本实用新型β-羟丁酸电化学传感器准确度的线性图；

图3是本实用新型β-羟丁酸电化学传感器65℃加速老化3天、7天、10天的相对偏差示意图；

其中，1-基片层，11-进样缺口；2-电极层，21-工作电极，22-对电极，23开机电极，24-导线；3-绝缘层，31-试剂窗口；4-中隔层，41-亲水窗口，42-排气窗口；5-β-羟丁酸电化学传感器。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本实用新型所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本实用新型保护范围的限制。

如图1所示，本实施例的β-羟丁酸电化学传感器的结构包括：基片层1，前端留有半圆形的进样缺口11；位于基片层1上的电极层2，电极层2包括工作电极21和对电极22以及开机电极23和导线24；位于电极层2上的绝缘层3，绝缘层3处开有试剂窗口31，暴露工作电极21和对电极22的工作部分；试剂窗口31用以限定反应试剂；粘贴于绝缘层3上的中隔层4，中隔层4留有亲水窗口41和排气窗口42；亲水窗口41和排气窗口42以及试剂窗口31构成进样空间。

其中，基片层1材质为聚对苯二甲酸二乙酯；工作电极21和对电极22的材质为碳；开机电极23和导线24的材质为银；绝缘层3的材质为疏水性材料；中隔层4为聚丙烯酸单面胶。

本实施例的β-羟丁酸电化学传感器的制备方法如下：

首先按照表1调配完成液态的反应试剂，其中β-羟丁酸脱氢酶(型号：HBD-301,167U/mg)，心肌黄酶(型号：DAD-311，841U/mg)和辅酶(β-NAD⁺)均购自日本东洋纺(TOYOBO)。然后通过点液的方式将液态的反应试剂配置到试剂窗口31，每支β-羟丁酸电化学传感器5的负载量在1.3mg-1.7mg。在30℃-40℃烘道段，40℃-50℃烘道段，50℃-60℃烘道段中依次热处理10分钟。贴合中隔层4，经过压合，裁切后，将β-羟丁酸电化学传感器5存放于带有分子筛干燥剂的密闭塑料筒。

表1：液态的反应试剂组成

本领域普通技术人员应当理解，为了测定被分析物的量，需要获得相应的电化学信号；更具体地，计时电流法的β-羟丁酸电化学传感器5通过获取未知β-羟丁酸浓度的血液样本的相应的电流信号，然后通过校准方程换算成血液样本的β-羟丁酸浓度值。如何可以建立和使用这种校准方程对本领域普通技术人员来说是熟知的。

准确度的线性评估分为对照组和试验组。利用雅培公司的β-羟丁酸试纸(Abbott,FreeStyle Optium Bloodβ-Ketone Test Strips，Lot:75001HO9)作为对照产品，以本实施例的β-羟丁酸电化学传感器5为试验产品进行准确度的线性比对。实验过程：将筒装β-羟丁酸电化学传感器5在23℃±2℃的室温条件下放置30分钟以上。血液样本的要求如下：红血球压积比调整为42％±2％；氧分压控制在65mmHg±5mmHg；共计7个浓度段的β-羟丁酸浓度的全血样本：浓度一处于0-3mg/dL、浓度二处于6±3mg/dL、浓度三处于20±3mg/dL、浓度四处于40±3mg/dL,浓度五处于60±3mg/dL,浓度六处于80±3mg/dL和浓度七处于100±3mg/dL。每个浓度段血液样本，对照产品测试一次获得对照组测试值，试验产品重复测试5次计算获得试验组平均值，测试结果见表2。以对照组测试值为横坐标，以试验组平均值为纵坐标作线性比对图，如图2所示。

表2：β-羟丁酸电化学传感器5的准确度评估测试数据

从表2可以看出，β-羟丁酸电化学传感器5的测试值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)较小，重复性很好。从图2可以看出，β-羟丁酸电化学传感器5的测试值和雅培公司的β-羟丁酸试纸测试值的相关系数平方(R²)大于0.99，具有良好的准确度。

依据范特霍夫规则(Vant Hoff rule)和阿伦尼乌斯方程(Arrhenius equation)，65℃下加速老化的7天可以近似视为真实的室温存储条件下的1年，65℃下加速老化的14天可以近似视为真实的室温存储条件下的2年，这对本领域普通技术人员来说是可以理解的。比如，专利CN100416266C介体稳定的试剂组合物及其用于电化学分析物测定的方法，涉及讨论电化学试剂组合物可以使介体稳定保存，采用了在56℃下放置2周加速老化的实验条件。采用加速老化的评估方式有利于节省产品开发的时间成本。

本实施例评估一种β-羟丁酸电化学传感器5的加速老化的热稳定性的方法为：实验分为对照组和试验组，以5℃下储存的β-羟丁酸电化学传感器作为对照组，在高温65℃下储存的同一批次的β-羟丁酸电化学传感器作为试验组，分别测试血液样本，得到电流值I5℃，I65℃；计算相对偏差，即I65℃/I5℃*100％-1。以相对偏差量化评估β-羟丁酸电化学传感器5的加速老化的热稳定性。

加速老化的实验条件：将各自同一批次的筒装β-羟丁酸电化学传感器5分别存储于5℃±1℃下、65℃±1℃烘箱里3天，7天和10天。

加速老化评估的实验过程：实验前，将筒装β-羟丁酸电化学传感器5在23℃±2℃的室温条件下放置30分钟以上。血液样本如下：红血球压积比调整为42％±2％；氧分压控制在65mmHg±5mmHg；共计7个浓度段的β-羟丁酸浓度的全血样本：浓度一处于0-3mg/dL、浓度二处于6±3mg/dL、浓度三处于20±3mg/dL、浓度四处于40±3mg/dL,浓度五处于60±3mg/dL,浓度六处于80±3mg/dL和浓度七处于100±3mg/dL。5℃±1℃和65℃±1℃条件下放置的β-羟丁酸电化学传感器5分别测试7个浓度段血液样本，每个浓度段血液样本，对照产品重复测试5次计算获得对照组平均值，试验产品重复测试5次计算获得试验组平均值。稳定性评估实验的数据处理：同一浓度段下，计算获得5℃下存储的β-羟丁酸电化学传感器对照组平均值和在65℃下储存的β-羟丁酸电化学传感器试验组平均值，计算相对偏差I65℃/I5℃*100％-1。以相对偏差量化评估β-羟丁酸电化学传感器的加速老化的热稳定性。

表3：β-羟丁酸电化学传感器65℃加速老化3天的评估测试数据

表4：β-羟丁酸电化学传感器65℃加速老化7天的评估测试数据

表5：β-羟丁酸电化学传感器65℃加速老化10天的评估测试数据

从表3、表4和表5可以看出β-羟丁酸电化学传感器在65℃储存3天、7天和10天的条件下加速老化后，电流值的相对偏差在15％以内，表明热稳定性较好(如图3所示)，可以满足真实室温存储条件下的1年的有效期。