鉴定诱导未分化或去分化的实体肿瘤细胞(再)分化的制剂的方法与流程
本发明包括一种鉴定在肿瘤细胞中诱导(再)分化的制剂的检测，所述制剂是基于两种标记物乳酸(作为分解代谢中无氧糖酵解的终产物)和中性脂质(作为合成代谢中性脂质合成的终产物)的新型组合应用。该基于细胞的系统的特征还在于新的液体处理步骤，其使得即使在至少七天的较长时间后也可以进行有效的高通量筛选，其特征还在于新的可行性检测。
可以分别通过离心以及基于新开发容器的新系统向微量滴定板中添加或从微量滴定板中去除培养基。首次在离心分离后，无创性、无标记、成本适中、物理地，通过吸收以及有活力的粘附细胞的细胞粘附的标准创新性地测定细胞活力。由于细胞粘附的减少对于程序性细胞死亡是特异性的，所述用于测定细胞活力的创新性方法可以首次特异性的用于检测凋亡与坏死。该方法特别适合于高通量筛选。去分化和未分化的细胞分别代表了肿瘤疾病的重要病理生理特征。
恶性肿瘤疾病是全世界范围内代表性的主要健康问题，并且在工业化国家中，是继心血管疾病之后的主要健康问题。根据“德国癌症协会(deutschekrebsgesellschaft)”的信息，仅在德国，每年就有约500.000人因癌症而患病。由于大多数癌症疾病在年龄较大时发生，由于人口结构的变化，预计发病率会进一步增加。专家估计，到2050年，癌症病例将增加30％。尽管进行了大量的研究工作并有了新的分子生物学发现，许多恶性肿瘤的预后仅得到勉强改善。由于对难以治疗的肿瘤实体的成功治疗选项有很高的医学需求，因此对新制剂的需求非常高。在大多数情况下，实操指南建议采用化学疗法进行治疗，但这不能进行肿瘤特异性治疗，并且患者会产生许多不良反应。
现代抗癌药物开发的目标是具有低毒性并具有高特异性和抗肿瘤作用的药物。一类这样的抗癌药物是分化诱导剂，其已成功地用于治疗不同形式的急性白血病。除其他作用外，这些药物还可以激活细胞的肿瘤防御机制，这也与高细胞分化状态(例如通过凋亡或有效的抗原呈递的程序性细胞死亡)相关。这些药物具有改善现有抗肿瘤治疗的巨大潜力。然而，迄今为止，在实体瘤中导致(再)分化阻滞的机制仍鲜为人知。新的分子生物学研究表明，基于表观遗传表达模式，这些肿瘤可分别分为分化程度较高或分化程度较低的肿瘤。其中，分化程度较高的肿瘤预后较好。与基因突变相反，表观遗传变化是可逆的，因此特异性分化诱导剂也可能会改善实体瘤的治疗。在这种情况下，特别令人感兴趣的是，分化诱导剂可以使具有高致瘤性的肿瘤亚群(所谓的肿瘤干细胞)发展为侵袭性更低且分化程度更高的肿瘤细胞。
图1显示了肿瘤干细胞的发育和致瘤性的方式。这些具有高干细胞特性的细胞可能定义了许多肿瘤的恶性程度。迄今为止，它们的发育(上方箭头)尚未被完全理解，并且可能是非常异质化的。一方面，在肿瘤发生的背景下，它们被称为“源细胞”，被认为是导致肿瘤异源细胞形式发育的细胞。另一方面，还讨论了它们是从具有低干细胞特性的肿瘤细胞发育而来，尤其可能在化疗下发生，并决定治疗的成功。已知分化诱导剂降低了肿瘤干细胞的干细胞特性，并将其发展为恶性程度更低且分化程度更高的肿瘤细胞(下方箭头)。肿瘤细胞的较低干细胞特性与细胞的肿瘤防御机制的增强(见上文)以及治疗耐药性的发展的降低和治疗后复发风险的降低有关。
对已知制剂的首次研究表明，它们能够强烈地改变细胞的基因表达模式并靶向不同的细胞分化阻滞剂(例如组蛋白脱乙酰基抑制剂)，这表明应用表观遗传作用剂还具有很大的改善实体瘤(例如乳腺癌、胰腺癌和肺癌)治疗的潜力。然而，迄今为止，在药物市场上还没有专门开发通过诱导分化从而治疗实体瘤的抗癌药物，这可能是由于对病理生理学的了解很少。特别缺乏特异性地针对导致实体瘤分化阻滞的病理生理机制的制剂。
目前开发的高通量筛选系统是用于鉴定白血病或成神经细胞瘤中的(再)分化制剂，其针对被描述为在分化细胞中高表达的区别基因的表达谱。然而，由于实体瘤中基因表达谱的高度异质性，该方法的特异性较低和假阳性率较高。为了减少这些特征，这些系统需要对大量基因进行平行分析，从而丧失了高通量筛选的有效且广泛的应用。或者，存在可用的检测系统，其通过高含量成像分析形态变化和/或已定义的蛋白标记。但是，这些系统复杂且成本高昂，需要非常多的辅助工作和非常大的计算机输出才能对庞大的数据进行有效分析。因此，这些系统不能用于高效且广泛的高通量应用。
目前，需要一种鉴定制剂的方法，其中，该制剂可以分别诱导肿瘤细胞分化并克服肿瘤特异性分化阻滞。该方法应具有高特异性。此外，假阴性结果的数量最好也是低的。此外，该系统应能够进行高通量测试，这意味着可以在短时间内研究大量不同的物质。在这种情况下，财务成本也代表一个相关因素。该系统应该经济地定价。这包括细胞活力测试，该测试必须进行新化合物的高通量筛选，并最好以节省成本的方式在主要测试中实施。对于分别诱导肿瘤、细胞分化和克服肿瘤特异性分化阻滞的制剂的鉴定，对量化由于细胞凋亡而丧失活力的细胞特别感兴趣。通过凋亡导致程序性细胞死亡的能力被认为是分化细胞的特征，并且可以通过在肿瘤细胞中进行表观遗传(重)编程诱导该能力(el-metwally，t.h.&pour,p.m.类视黄醇诱导的胰腺癌再分化-凋亡序列和线粒体：事件中推荐的必选序列.胰腺杂志(2007))。在高通量筛选的应用中，对凋亡细胞的有效定量非常复杂，并且与高昂的财务成本有关(hsu，k.w.等，无创性细胞凋亡检测传感器(niads)在组蛋白去乙酰化抑制剂(hdaci)诱导的乳腺癌细胞死亡中的应用.int.j.mol.sci.(2018).doi:10.3390/ijms19020452).
令人惊讶地是，研究表明，由于乳酸和中性脂质的新型定量组合，使得有效鉴定在肿瘤细胞中诱导(再)分化的化合物成为可能。根据肿瘤发生的模型，其被称为再分化(克隆进化模型)或分化(肿瘤干细胞模型)。独立于上述术语，本发明的方法包括可以诱导肿瘤(干)细胞向恶性程度较低(分化程度更高)的肿瘤细胞或细胞的转化的化合物。
此外，令人惊讶的是，在本发明的方法中，尤其是在以高通量形式进行的情况下，向所使用微孔板(例如，多至1536孔的规格)的孔中添加和从中去除各种液体(例如细胞悬液、培养基、缓冲液、试剂等)可通过简单的离心进行，该离心以(a)温和、(b)同步、(c)平稳、(d)无气泡、(e)完全、(f)无菌、(g)高效且(h)成本适中的方式利用由局部装置(a)和(b)组成的新开发设备进行。该设备可与市售手动移液器配合使用，并不一定需要多通道移液器或复杂的自动化系统。除离心外，所有任务均可在无菌条件下使用市售的细胞培养台进行。
最后，可以开发一种新方法，该方法通过吸收测定以及离心后的标准细胞粘附，可以物理地和无标签地测定微量滴定板中粘附生长的细胞的细胞活力。所开发的方法可首次以成本适中且快速有效的方式测定目标细胞凋亡的完全诱导，并可同时应用于高通量系统。
在第一个实施方案中，本发明基本目的的解决是通过一种鉴定在未分化或去分化细胞，特别是肿瘤细胞中诱导(再)分化的化合物的方法，该方法包括：
a)提供由去分化或未分化肿瘤细胞组成的细胞培养样品,
b)将目标化合物与所述的细胞培养样品接触,
c)随后，测定与未处理细胞相比的第一标记物乳酸的相对浓度，和
d)随后，测定与未处理细胞相比的第二标记物中性脂质的相对浓度，
其中，如果需要，步骤c)和d)可以以相反的顺序进行
通过乳酸和中性脂质的测量和随后对结果的综合分析，本发明的方法首次能够评估新型化合物是否能够在细胞中诱导(再)分化并可因此用于肿瘤疾病的治疗处理。
对于本发明，肿瘤细胞包括所谓的肿瘤干细胞。未处理的细胞定义为未用目标化合物处理过的细胞，这意味着它们并未与化合物发生物理接触。对于选定的基因表达谱，必须考虑到，由于实体瘤的表观遗传异质性非常高，单个选定基因的检测不足以定义目标肿瘤的(再)分化。已知的在分化细胞中以增强或减少的方式发生的代谢过程在肿瘤细胞中的异源性变化较小，并且在肿瘤细胞(再)分化时更保守地向分化细胞代谢谱变化。因此，现在可以证明，当使用高通量检测系统将肿瘤细胞的新陈代谢朝着分化细胞的新陈代谢的方向改变时，可以特别地显示变性肿瘤细胞的(再)分化，并具有更少的假阳性结果。
本发明首次表明，标志物乳酸和标志物中性脂质的组合定量，特别是在合成代谢和脂质减少的细胞培养条件下，可用于特异性鉴定实体瘤中的(再)分化化合物。尽管两个标记物都已相互独立地被描述为细胞分化的特征，但只有组合应用才能有效确定(再)分化，特别是在肿瘤细胞中的(再)分化。
最近的研究表明，肿瘤细胞可以通过β氧化和减少无氧糖酵解来灵活满足其增加的能量需求，而不会降低恶性程度(porporato,p.e.,filigheddu,n.,pedro,j.m.b.-s.,kroemer,g.&galluzzi,l.线粒体代谢和癌症.cellres.(2017).doi：10.1038/cr.2017.155)。这与之前的假设相反，之前认为，肿瘤细胞在有氧条件下进行无氧糖酵解，这种现象被称为warburg效应。在能量通过β氧化覆盖的情况下，掺入脂滴中的中性脂质可作为肿瘤细胞不断增长的能量需求的能量来源(cabodevilla，a.g.等，完全营养剥夺期间的细胞存活依赖于脂滴驱动的脂肪酸的β氧化.j.biol.chem.(2013).doi:10.1074/jbc.m113.466656)。因此，单独的乳酸测定不是确定肿瘤细胞(再)分化的充分标准，只有与额外的细胞的中性脂质的浓度增加(相对于未处理细胞)结合时，乳酸才能充分地用于推断(再)分化。
另外，本发明可以排除例如仅抑制糖酵解的化合物。
因此，两种标记物的新颖组合对于所述检测方法是必不可少的。
首次表明，最强的合成代谢激素胰岛素的添加放大了(再)分化肿瘤细胞中两种标记物的变化，基本上是朝着合成代谢的方向，就像在非肿瘤细胞中的胰岛素的描述一样。因此，优选在细胞培养期间以及在根据本发明的步骤b)期间存在胰岛素。
在这种情况下，目前可以首次有效地利用合成代谢激素的合成代谢作用改善通过所述的两种标记物对(再)分化的检测。如果相应的激素受体仅在目标(肿瘤)细胞的(再)分化细胞上表达，将是特别的创新性的情况。已知这是首次使用，例如与分化的乳腺上皮细胞相反，mda-mb-231细胞的催乳素受体阴性或低表达(lopez-ozuna,v.m.,hachim,i.y.,hachimm.y.,lebrun,j.j.&ali,s.三阴性乳腺癌催乳素促分化途径的研究：对预后和潜在治疗的影响.科学报告(2016))。因此，合成代谢作用的催乳激素的添加仅诱导(再)分化细胞中的合成代谢方向上的上述标记物的变化。通过与/不与激素一起的靶向温育，以及与所用标记物乳酸和中性脂质的定量分析结合，这是由于激素受体结合的强大生理特异性，首次有可能实现一种分析作为生理学受体激活的结果的催乳素受体表达的检测方法。此外，可以涵盖受体结合后下游信号传导级联的分析。作为结果，可以得出生理学功能受体表达的结论。相比之下，胰岛素受体b的功能性表达以及亚型a和b的比例，分别可以通过与/不存胰岛素一起的靶向温育进行分析。因为与主要在未分化细胞上表达的同种型a相反，只有主要在分化细胞上表达的同种型b的特异性受体激活诱导了(再)分化细胞在合成代谢方向上的所述标记物的变化。
对于特别低分化的肿瘤细胞，例如三阴性乳腺癌细胞，大多数从细胞外来源获得中性脂质(antalis，c.j.等，雌激素受体阴性的基底样乳腺癌细胞中的高acat1表达与ldl诱导的增殖有关。乳腺癌研究治疗(2010).doi：10.1007/s10549-009-0594-8)。这可能是首次证明，无脂质或脂质含量低的细胞培养条件有利于增加与肿瘤细胞(再)分化相关的中性脂质。由于分化的细胞可以在厌氧条件下将其代谢过程转换为无氧糖酵解，为了检测由于(再)分化导致的乳酸产量的增加，必须确保应用有氧培养条件。
两种标记物可以直接或间接地定量，例如通过与代谢物浓度相关的酶活性。本发明的表型方法能够在目前未知的靶结构中实施，这代表了开发创新药物的重要技术优势。
根据本发明的方法，乳酸和中性脂质首次用作高通量测试系统中鉴定诱导(再)分化的化合物的标志物。通过这样做，该测试系统还可以扩展到肿瘤以外的其他疾病，其病理生理学提示细胞的去分化或分化阻滞起着至关重要的作用。举例而言，慢性炎症性疾病，如莫伯斯-克伦(morbuschron)、溃疡性结肠炎或包括nash(非酒精性脂肪性肝炎)在内的肝炎可能就是这种情况。进一步的例子是退行性疾病，如关节炎、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症(als)或各种肌肉疾病，以及各种代谢性疾病，如淀粉样变性或脂沉积症。
除了研究病理生理过程外，该测试系统还可用于分析健康干细胞的生理分化。在这种情况下，将测试系统与健康干细胞结合后，可以鉴定出在健康组织中特异性诱导生理分化的化合物。这可以起到例如治疗irds(婴儿呼吸窘迫综合征)的作用。
此外，当使用健康的干细胞时，可以显示化合物的疾病特异性作用，即特异性靶向和/或消除病理生理学分化阻滞。这样，有可能排除该化合物对健康干细胞的影响，而预期不会诱导分化。
因此，还可以研究通过前述测试方法鉴定的在实体瘤中诱导(再)分化的候选药物用于上述应用的进一步治疗潜力。
在干细胞的生理分化过程中，用于能量产生的无氧糖酵解减少和氧化磷酸化增加。这个过程代表了细胞分解代谢的主要部分。特别是在有氧条件下，分化细胞中普遍存在由氧化磷酸化产生的能量。相反，有氧条件下，在大量肿瘤细胞中被发现有无氧糖酵解的增加。
在本发明的方法中，首次在有氧条件下将无氧糖酵解的减少用作代谢指标，从而在(高通量)筛选系统中鉴定实体肿瘤细胞的(再)分化。无氧糖酵解的定量可以通过测量乳酸浓度来实现。乳酸的产生可以通过ph值变化来确定，从而可以通过指示剂进行间接浓度测定。使用碳酸氢盐缓冲的细胞培养基，ph变化可以优先地、创新性地关联厌氧乳酸的产生：由于培养箱提供的co2-空气(co2-atmosphere)的co2恒定分压较高，这决定了液体中溶解的co2的浓度，因此由能量储存的有氧降解产生的相对较低量的co2被传递至平衡状态(co2(液体)<->co2(气体))，导致培养基中的ph值不变。因此，ph变化受细胞co2产生的影响可忽略不计，并且创新性地将其与碳酸氢盐缓冲液中培养(在适当的co2-空气中温育，例如5-10％co2,1,5-2,2％碳酸氢盐)的厌氧乳酸生成(与非碳酸氢盐缓冲的培养基相比)更精确地关联。
可替代地，但优选地，细胞产生的乳酸盐的量也可以通过市售的测试系统进行酶学测定。可替代地，但优选地，可以分析细胞乳酸脱氢酶(ldh)的活性从而定量标记物乳酸。细胞ldh的活性也与无氧糖酵解和乳酸的形成有关。
此外，令人惊讶且显而易见的是，特别是在合成代谢细胞培养条件下(例如在胰岛素的存在下)，除了乳酸外，中性脂质的储存代表了用于验证实体瘤中(再)分化的合适的第二标记物。可以使用适当的荧光配体进行验证。例如，使用可市售的配体
脂质耗尽和脂质减少的培养基均基于市售的化学成分确定的基础培养基，但该培养基不含制造商提供的蛋白质、生长因子和脂质。根据各自的细胞系，或者不添加脂质源(脂质耗尽的培养基)，或者在基础培养基中补充一定浓度的脂质源(脂质减少的培养基)。
本发明的方法可以只用几个样本来进行。但是，该方法也可以作为同时处理各种微量滴定板的高通量筛选(hts)系统来进行。高通量筛选的定义如前述的szymanski等人所述(高通量筛选药物发现的适应性–毒理学筛选试验；int.j.mol.sci2012，13，427-452.)。从低通量筛选到超高通量筛选，本发明的方法适用于表2中提到的所有筛选模式。然而，本发明的方法首次提供了高通量筛选甚至是超高通量筛选。
特别优选的，本发明方法的实施在微量滴定板中进行。适当的微量滴定板的使用可以将所提供的方法实现为hts系统。因此，例如可以使用384孔微量滴定板在短时间内一次性分析384个样品。
根据情况需要，自然可以使用其他形式的微量滴定板。微量滴定板的尺寸受到分析两种标记物浓度的可能性的限制。只要通过光谱(可以在短时间内实施)进行分析，就可以进行高通量筛选，从而更快地鉴定化合物。同样地，可以就化合物的鉴定对不同的细胞培养样品进行研究，其中所述细胞培养样品例如由不同的肿瘤细胞组成。因此，本发明的方法不仅能够鉴定化合物，而且能够鉴定在已知肿瘤中具有已知作用的化合物对其他肿瘤实体的作用。
优选地，在本发明的方法中，微量滴定板用透气性密封箔密封。这样可以防止液体、固体或气体杂质渗透到各个样品中，并通过扩散实现均匀的气体交换。
对于本发明的方法，必须提供细胞培养探针。该探针由与添加的化合物反应的肿瘤细胞组成。随后加入化合物，同时细胞培养持续进行。为此，需要添加通用培养基或缓冲液组分。在一个特别优选的实施例中，通过本发明的局部装置(a)和/或(b)来添加和去除介质或缓冲液成分。
本发明方法的优选实施方案包括以下步骤：
a)提供由去分化或未分化肿瘤细胞组成的细胞培养样品,
b)将目标化合物与所述的细胞培养样品接触,
c)随后，测定与未处理细胞相比的第一标记物乳酸的相对浓度，和
d)随后，测定与未处理细胞相比的第二标记物中性脂质的相对浓度，
其中，如果需要，步骤c)和d)可以以相反的顺序进行，并且培养基和/或缓冲液组分的添加通过局部装置(b)进行和/或培养基和/或缓冲液的去除通过局部装置(a)进行。
在附图中示意性地示出了局部装置(a)和局部装置(b)。图2至图7示出了局部装置(a)，而图8至图11示出了局部装置(b)。这些图显示了不同的视图，即：
图2：局部装置(a)的俯视图
图3：局部装置(a)的侧视图(长边)
图4：局部装置(a)的侧视图(横向边)
图5：局部装置(a)的底视图
图6：局部装置(a)的透视图，显示了微量滴定板的接触面以及简化的微量滴定板拆卸的凹槽
图7：从角落看的局部装置(a)的透视图
图8：局部装置(b)的俯视图
图9：局部装置(b)的侧视图(长边)
图10：局部装置(b)的侧视图(横向边)
图11：从角落看的局部装置(b)的透视图
因此，本发明在另一个实施方案中，涉及一种用于通过离心从细胞中除去液体的容器(局部装置(a))，其特征在于，包括：
-4个侧壁(a1、a2、b1、b2)，其中两个相对的侧壁具有相同的长边(la、lb)，从而获得矩形形状，
-平坦的底部(c)，所述底物以下述方式与各个侧壁连接：所有连接区域以不透液体的方式连接，
-各个侧壁均具有朝向容器内部的突起(da、db)，
-彼此相对的4个侧壁中的2个具有凹槽(e1、e2)，该凹槽位于在各个侧壁的上表面的侧壁的长边la的中间。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种用于通过离心来添加液体以培养细胞的微量滴定板(局部装置(b))，所述滴定板包括表面(1)和孔(2)，所述孔锥形朝向底部(3)并存在开口，特别是圆形开口。微量滴定板底部(3)的所述开口，以使得开口的直径与各个孔内液体的表面张力成比例的方式调节，并以使得液体仅在比重力强的力的影响下才能逸出的方式调节。
所述局部装置(a)和(b)将在下面与本发明的方法一起描述。
创新性地，为了测定步骤c)和d)中提到的标志物，可以洗涤细胞培养物样品和/或可以进行一种或多种培养基更换。例如，可以使用已知的移液方法执行该步骤。创新性地优选地，该步骤是通过离心进行的。
与抽吸液体的常规(多通道)移液系统相比，本发明的方法优选在添加化合物或荧光配体之前通过经济高效的短暂离心从微量滴定板的各个孔中去除含血清的培养基或低血清培养基或无血清的培养基。
因此，开发了一种容器(部分装置(a))，可与通常使用的离心吊架一起使用。将微量滴定板结合到容器中，孔的开口向下指向容器内腔，微量滴定板被固定在容器壁上。结果，可以将各个孔中的液体同时排入由容器提供的空腔中(图2-7；局部装置(a))。与已知的使用抽吸去除液体的移液方法相反，这使得高效、温和、无菌且完全地从单个孔中去除液体成为可能。已知的使用抽吸去除液体的移液方法通常会导致粘附生长的细胞丢失和/或导致液体残留物永久残留在细胞中。如果需要，可以将局部装置(a)与各种自动化移液器一起安装。
对于使用基于粘附生长的细胞的细胞培养技术进行的分析，在离心几秒后(例如100-300xg)，培养基可以被完全除去并收集，从而在微孔板孔中不存在液体残留(残留体积)。因此，使得有效减少和/或避免洗涤步骤成为可能，还可以缩短的测试持续时间和减少的洗涤液用量。在随后的细胞培养试验中，未观察到细胞/细胞系活力的降低。
有效去除培养基和避免洗涤步骤显著提高了基于细胞的分析的稳健性。此外，与使用各种抽吸附件相比，通过局部装置(a)和离心有效去除上清液，还可以减少/避免洗涤步骤，可以有效去除液体而没有残留物，并且可以避免发生在不基于细胞的分析(例如基于elisa的分析)系统中的人为假象。
通常，可以通过多通道机械头(例如96至1536个通道)实现向微量滴定板的所有孔中同时添加培养基或液体。可替代地，首次发现还可以使用常见的多通道/单通道移液器或单通道/多通道机械头(例如1-16通道)结合特别设计的微量滴定板来完成(图8-11；局部装置(b))。
-在第一步中，特别设计的微量滴定板由轻微锥度朝向底部的孔组成，其中已内置了(例如圆形)开口，用于添加待添加的液体。每个孔都可以单独装满液体。由于表面张力，流体将不会流过轻微锥度朝向底部开口的各个孔底部的(例如圆形)开口。在此，必须根据液体的表面张力调整钻孔的直径。低表面张力(例如由于存在清洁剂)，需要较小的直径。较高表面张力的液体可使直径更大。或者，可以通过将微量滴定板完全浸入液体中来一步填充微量滴定板，该微量滴定板由轻微锥度朝向底部开口的各个孔组成。
-在第二步中，将由轻微锥度朝向底部开口的各个孔组成且用液体(所述液体是应当转移至市售的微量滴定板中的液体)填充的微量滴定板适当地放置，使得所述微量滴定板的轻微锥度朝向底部开口的孔不与市售微量滴定板的孔或孔中的液体接触。为了在无菌条件下转移液体，将配件罩盖添加到局部装置(b)上。现在，可以通过离心板进行将液体从由轻微锥度朝向底部开口的各个孔组成的微量滴定板转移到市售微量滴定板的操作。这样做时，液体将自动独立于所施加的转速，并以尽可能低的压力从微量滴定板的稍微锥度朝向底部开口的孔中被压出至市售微量滴定板的孔。该过程独立于离心机所施加的转速的原因是，当径向力变得比表面张力(该表面张力使轻微锥度朝向底部开口的孔中的液体保留)更强时，液体将被转移至市售微量滴定板的孔中。旋转速度的进一步提高可能可以使微量滴定板的轻微锥度朝向底部开口的孔中的由于粘附而残留的液体残留物完全转移。这使得多孔的微量滴定板可用于进一步的应用，而无需在其间进行任何清洁步骤。
总而言之，已经表明，通过将局部装置(b)与市售的细胞培养离心机一起使用，并且将所施加的转速从零增加到例如最高300xg，可以以靶向的、温和、同步、均匀和完全且经济高效的方式，将各液体转移到微量滴定板的各个孔中。
此外，显示了使用离心和所述局部装置(a)，可以将一种新的、经济、高效的用于粘附生长细胞的活力测试利用微量滴定板整合到细胞培养领域中。
本发明方法的优选实施方案还包括以下步骤：
e)通过定量离心后的吸光度确定粘附生长的细胞的细胞活力，和
f)在信号完全降低至背景水平的过程中确定细胞中细胞凋亡的完全诱导。
总之，本发明方法的优选实施方案包括以下步骤：
a)提供由去分化或未分化肿瘤细胞组成的细胞培养样品,
b)将目标化合物与所述的细胞培养样品接触,
c)随后，测定与未处理细胞相比的第一标记物乳酸的相对浓度，和
d)随后，测定与未处理细胞相比的第二标记物中性脂质的相对浓度，其中，如果需要，步骤c)和d)可以以相反的顺序进行；
e)通过定量离心后的吸光度确定粘附生长的细胞的细胞活力，和
f)在信号完全降低至背景水平的过程中确定细胞中细胞凋亡的完全诱导。
特别优选的过程包括以下步骤：
a)提供由去分化或未分化肿瘤细胞组成的细胞培养样品,
b)将目标化合物与所述的细胞培养样品接触,
c)随后，测定与未处理细胞相比的第一标记物乳酸的相对浓度，和
d)随后，测定与未处理细胞相比的第二标记物中性脂质的相对浓度，其中，如果需要，步骤c)和d)可以以相反的顺序进行
e)通过定量离心后的吸光度确定粘附生长的细胞的细胞活力，和
f)在信号完全降低至背景水平的过程中确定细胞中细胞凋亡的完全诱导；
其中，
培养基和/或缓冲液组分的添加通过局部装饰(b)进行和/或
培养基和/或缓冲液组分的去除通过局部装置(a)进行。
令人惊讶地是，显然，使用离心和所述局部装置(a),可以将一种新的、经济、高效的用于粘附生长细胞的活力测试利用微量滴定板整合到细胞培养领域中。
因此，可以通过活力标准细胞粘附来确定粘附生长的细胞的细胞活力，通过无创性物理检测市售微量滴定板(例如，聚苯乙烯-孔底部，其塑料表面没有任何变化)的吸收进行测定。这样就可以有效、快速、非侵入性和无标记地将每个微量滴定板孔的不同测量值标准化为活细胞的数量。
可以根据细胞核苷酸和/或芳香族氨基酸的特征对活细胞进行无标记定量，基于260nm至280nm的生理学吸收光的最大吸收(dna/rna最大吸收：260nm；蛋白最大吸收：280nm)。这是首次使检测蛋白成为可能，因为通过局部装置(a)和离心完全去除了培养基，使得微量滴定板的孔中不含有会影响检测的培养基组分，例如蛋白或缓冲液组分。作为光吸收的替代，可以对光扩散或细胞自发荧光进行定量。此外，可以使用一种在测量前使用荧光团或生色团与细胞相互作用或掺入细胞的方法，在这种情况下，可以相对于背景信号定量剩余的活细胞数量。作为替代方案，可以通过(高容量)显微镜确定剩余的活细胞数量。该方法可以作为终点测量来实施，或者可以通过定义动力学来实施，所述动力学是通过设置的培养基变化和在培养基添加之前/去除之后进行检测来定义的。如果以比接触抑制剂导致的细胞生长减少的密度低得多的密度接种细胞，那么也可以进行测定增殖的动力学试验。
由于在这种非侵入性、无标记方法中未发生细胞裂解，因此可直接获得活细胞用于进一步研究。所描述的方法可用于毒性研究以及免疫毒性试验。在后一种情况下，通过离心去除非粘附免疫细胞，从而不会干扰吸收的测量。
与坏死细胞相反，凋亡细胞具有细胞粘附性丧失的特征，导致其与塑料表面的附着减少(kwon,h.-k.,lee,j.-h.,shin,h.-j.,kim,j.-h.&choi,s.细胞死亡中细胞粘附和核膜纳米形貌的结构和功能分析.sci.rep.(2015).doi:10.1038/srep15623)。开发了一种方法，该方法将离心后相对背景水平的光吸收下降，与用目标化合物预处理的细胞的完全凋亡诱导相关联。由此，通过离心产生的径向力除去非粘附/低粘附细胞，这使得待检测的微孔板孔中的光吸收降低。由于凋亡诱导的细胞粘附终止后的细胞的不可逆分离，原始粘附细胞的完全脱离与在任何时间点检测到的所有细胞的凋亡诱导有关。这也应用于凋亡囊泡，其是在细胞分离后发生的凋亡后步骤。该方法提供了一种新的、高效、非侵入性、无标记、有效且通用的凋亡标记物独立的方式来确定凋亡，尤其是在高通量应用中，其由于复杂的动力学难以对变量进行测量。
独立于测定的时间点，离心后在背景水平上检测吸光值表明了在各个微孔板孔中的目标细胞中发生了细胞凋亡的绝对诱导。由于凋亡细胞的活力代表了(再)分化的区别性特征(el-metwally,t.h.&pour，p.m.类视黄醇诱导的胰腺癌再分化-凋亡序列和线粒体：事件中推荐的必选序列.胰腺杂志(2007))，对凋亡的定量，特别是动力学和/或连续稀释的定量，可以与前述的标记物乳酸和/或中性脂质很好地结合，例如用于识别诱导分化的物质。因此，可以将有效的、同时间的代谢监测纳入试验中。
与步骤e)相比，该方法可以作为终点测量来实施，或者可以通过定义动力学来实施，所述动力学是通过设置的培养基变化和在培养基添加之前/去除之后进行检测来定义的。为了减少由于细胞增殖引起的影响，应为各个细胞系分别选择细胞密度和细胞培养技术(请参见应用实施例)。
在另一个实施方案中，本发明的基本任务的解决是基于标志物乳酸和中性脂质的应用，用于鉴定在肿瘤细胞中诱导(再)分化的化合物。关于标记物的检测，参考本发明的方法。
因此，在优选的实施方案中，本发明的方法的特征在于组合应用标志物乳酸和中性脂质来鉴定在未分化或去分化的细胞，特别是肿瘤细胞中诱导(再)分化的化合物。特别优选地，其特征在于，通过检测ph依赖性的酚红光学吸收的变化，对(合适的恒定的co2-空气中温育的碳酸氢盐缓冲的细胞培养基中的)乳酸浓度进行定量，并且，利用合适的中性脂质染色(荧光)染料(例如
以下应用示例进一步以非限制性方式描述了本发明所基于的任务：
实施例
为了提供均匀、融合的细胞层，将细胞(细胞系：a549、mda-mb-231和panc-1)以规定的密度接种，并在384孔微量滴定板中培养24小时。细胞密度的选择是以通过生长停滞来减少细胞增殖的方式。在接下来的步骤中，通过离心改变培养基，并加入目标化合物。对于mda-mb-231细胞，添加丁酸钠，对于a549细胞，添加丁酸钠和地塞米松(dm)。已知丁酸钠(对于a549，包括dm)具有分化诱导作用。
在最初孵育24小时(与细胞系相关的时间)后，某些细胞系可能需要更换为无血清培养基。仅在此之后，才进行目标化合物的添加。化合物的孵育时间取决于所选的肿瘤模型，应各自调整。如有必要，例如在24h到168h的孵育时间中，可以根据各自的细胞系进行一种/多种培养基更换，并可选地重复添加目标化合物。
在目标化合物的孵育时间到期后(取决于细胞系，从约48h到168h)，测定上清液中的乳酸浓度。因此，使用酚红作为指示剂检测样品的ph值变化，并将其与乳酸浓度相关联。为此，通过融合性细胞层分析微量滴定板。
随后，通过离心进行培养基更换，以完全除去培养基。任何残留的培养基可能会对第二标记物中性脂质的后续测量产生不利影响。
完全更换培养基后，添加荧光配体
诱导(再)分化的物质导致第一标记物乳酸减少，并且第二标记物中性脂质增加。为了以积极的方式分析两个标记物，第一个标记物在数学上转换为正值，意味着标记物1的高值现在代表标记物1的高度下降。与未处理细胞的平均值相比，可以检测、分析和评估各种化合物的(再)分化诱导能力。
在检测两种标记物之后，直接通过酶标仪中的吸收测定来确定粘附细胞的细胞活力。由此，测定的执行独立于先前进行的检测，并且不受先前添加荧光配体的进一步影响。
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