一种光电化学生物传感器及其制备方法与流程

本发明属于电化学检测领域，指一种光电化学生物传感器及其制备方法。

背景技术：

副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus，以下简称vp)是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌，是世界范围内重要的食源性致病菌。vp引起的食源性疾病已成为世界范围内的公共卫生问题之一。近年来，在亚洲(尤其是东南亚地区)、欧洲和北美洲均多次爆发了vp导致的食源性疾病。据我国食源性疾病监测网2003～2007年与2010～2014年统计分析数据显示，vp引起的食源性疾病已位居微生物食源性疾病的首位，海产品中vp检测已成为各地区食品风险监测的重要一环。

我国食品安全国家标准gb29921-2013对水产制品、水产调味品中vp进行了限量规定，可接受水平的限量值为100mpn/g(ml)，最高安全限量值为1000mpn/g(ml)。目前，我国vp的现行检测方法是gb/t4789.7-2013，该传统培养法准确性高；但检测过程通常需要4～5d，耗时长、操作繁琐，不能满足水产品质量安全快速反应体系的需求。

目前研究最多的vp快速检测技术是pcr技术、酶联免疫吸附技术和生物传感器技术。pcr技术操作过程较为繁琐，需要设备条件，且耗时相对较长。酶联免疫吸附技术在检测效率、特异性、现场适用性上具有优势，但由于vp抗体成本高，应用受到局限。生物传感器作为新型的检测手段，与传统的检测手段相比，具有方便、省时、精度高、设备简单、价廉，易于微型化等优点，并且数据的收集与处理也很简便，亦不会造成污染，可实现现场大通量样品的检测。光电化学生物传感器将传统的电化学传感器和光电化学结合起来，集合了二者的优点，背景信号较低，灵敏度较高。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速简便、准确灵敏的光电化学生物传感器，用于副溶血性弧菌的检测。本发明整合了纳米材料复合、量子点敏化、适配体分子识别、核酸外切酶i辅助循环等技术，构建光电化学生物传感器，建立了一种快速简便、准确灵敏的vp检测方法。

本发明完整的技术方案包括：

一种光电化学生物传感器及其检测副溶血性弧菌的方法，其步骤如下：

步骤1、制备bi2wo6-re纳米粒子

将2mmol的bi(no3)3·5h2o和1mmol的na2wo4·2h2o分别溶于40ml的乙二醇和20ml的0.6m稀硝酸溶液，搅拌至溶解完全，分别得到溶液a和溶液b。将稀土硝酸盐溶液加入到溶液a中搅拌均匀。再将淡黄色的溶液b逐滴加入到a的混合溶液中，用naoh溶液调节ph值到中性，搅拌使得混合溶液由淡黄色变为无色。将已经混合均匀的溶液转移到100ml的水热反应釜中，在一定温度下水热反应一定时间。冷却后先用乙醇然后再用去离子水清洗离心三次，在80℃干燥12h。干燥的粉体研磨，在一定温度下煅烧一定时间，随炉冷却到室温后再次研磨，得到bi2wo6-re。

步骤2、制备n掺杂的gqds

先将2g前驱物芘与80ml发烟硝酸混合后，在80℃下回流搅拌，将芘晶粒表面进行硝基功能化处理，取出反应物后过滤除酸后加入适量的氨水调节ph值，采用300w超声波分散处理后转移至聚四氟乙烯罐中，在一定温度下水热反应一定时间，待自然冷却后取出反应物过滤透析后在70℃下干燥得到n-gqds。

步骤3、gqds-vdna偶联物的制备

720μlgqds用100μl含有10mmedc和10mmnhs的水溶液在室温下活化30min，然后将600μl2μm过量的vp适配体vdna加入到上述gqds溶液中，持续搅拌过夜。所得溶液在4℃离心除去过量vdna，即得到gqds-vdna偶联物。

步骤4、构建检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器工作电极

将fto电极先后用丙酮、氢氧化钠、去离子水清洗，烘干备用。将10mgbi2wo6-re超声溶解于5ml水中，取20μl均匀溶液滴于面积为0.25cm²的fto电极上，自然晾干后，450℃空气气氛下煅烧30min，自然冷却至室温。再将fto/bi2wo6-re电极浸入0.01mhaucl4(ph＝4.5)溶液中40min，于300℃下煅烧2h形成金纳米颗粒，即得fto/bi2wo6-re/au电极。

将20μl在三(2-羧乙基)膦(tcep)(0.5μl，10mm)溶液中活化1h的2μmvp适配体vdna的互补dna(sdna)滴在fto/bi2wo6-re/au电极上，在4℃下孵化过夜。用tris-hcl(ph＝7.4，10mm)缓冲液冲洗除去未连接的sdna，然后用20μl6-羟基-1-己硫醇(mch)封闭1h。tris-hcl冲洗后，将20μlgqds-vdna偶联物滴在电极上，并在37℃下孵育1h使sdna与vdna杂交。用tris-hcl溶液冲洗后，在适配体电极上滴加20μl不同浓度含20uexo-i的vp溶液，孵育1h，用tris-hcl溶液冲洗后即得工作电极。

步骤5、构建检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器

将步骤4制备的工作电极插入光电化学池中，再将饱和甘汞电极和铂对电极插入，组成三电极体系，外接电化学工作站，辅以模拟日光氙灯光源系统(加装了am1.5太阳光谱模拟滤光片，可量化，具有标准性)，即组装成了光电化学适配体传感器，用于副溶血性弧菌的光电化学检测。

步骤1中，稀土硝酸盐溶液所用的稀土为er³⁺、yb³⁺双掺、tm³⁺、yb³⁺双掺或er³⁺、tm³⁺、yb³⁺多种稀土掺杂。

步骤1中，水热反应温度为160-200℃，水热反应时间为1-6h。

步骤1中，煅烧温度为400-800℃，煅烧时间为2-8h。

步骤2中，水热反应温度为160-220℃下，水热反应时间为8-16h。

步骤5中，光电化学检测是在室温下含有0.1m抗坏血酸(aa)的tris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4，0.1m)中进行，aa在光电流响应测试中作为电子供体。测试过程中由模拟日光氙灯光源系统产生光源，每10s开/关光源一次。光电系统外加电压为0.0v。在光电流响应测试前，向aa溶液通n2除氧15min。

本发明所构建的检测vp的光电化学适配体传感器是基于量子点敏化bi2wo6-re与exo-i的辅助循环作用的传感模式，其优点以及特色如下：

(1)bi2wo6-re/au复合结构为工作电极的基底材料，能吸收模拟太阳光产生光电流，掺杂稀土粒子的上转换效应拓宽了光谱响应范围，增大了光电流强度。

(2)利用gqds作为敏化剂敏化bi2wo6-re，实现信号放大，再利用exo-i辅助循环作用实现进一步的信号放大。未孵化时，量子点产生敏化作用，光电流强度响应增强。而当适配体传感器在vp和exo-i中孵化后，量子点远离电极表面，敏化作用大大减弱，光电流强度也显著降低。该传感器实现了检测电流信号的放大。

(3)通过vp菌体和其适配体的特异性结合，大大提高了实验的准确性以及特异性。

(4))vp检测时间短，成本低廉，潜在的便携性。

附图说明

图1为本发明光电化学生物传感器工作电极的构建过程。

图2为纯bi2wo6和er³⁺/tm³⁺/yb³⁺-bi2wo6样品的xrd图。

图3为样品bwo-31、bwo-32、bwo-33的上转换光谱图。

图4为纯bi2wo6和er³⁺/tm³⁺/yb³⁺-bi2wo6样品的光电流图。图中曲线a为纯bi2wo6，曲线b为er³⁺/tm³⁺/yb³⁺-bi2wo6。

图5为光电化学生物传感器的拟合标准曲线。其中图5(a)为滴加不同浓度副溶血性弧菌菌液的光电流图，图5(b)为拟合的标准曲线图。

图6为光电化学适配体传感器的特异性实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。如图1所示，本发明光电化学适配体传感器工作电极的构建过程如下：

步骤(1)制备bi2wo6-re纳米粒子

将2mmol的bi(no3)3·5h2o和1mmol的na2wo4·2h2o分别溶于40ml的乙二醇和20ml的0.6m稀硝酸溶液，搅拌至溶解完全，分别得到溶液a和溶液b。随后制备稀土硝酸盐溶液，稀土元素中，er³⁺、tm³⁺、yb³⁺的掺杂浓度分别为2mol％、2mol％、6mol％。将上述加入量的稀土硝酸盐溶液加入到溶液a中搅拌均匀。再将淡黄色的溶液b逐滴加入到a的混合溶液中，用naoh溶液调节ph值到中性，搅拌使得混合溶液由淡黄色变为无色。将已经混合均匀的溶液转移到100毫升的水热反应釜中，设置恒温烘箱的温度为180℃，并水热2h，然后随烘箱冷却至室温。接着先用乙醇然后再用去离子水清洗离心三次，在80℃干燥12h。干燥的粉体研磨，在600℃煅烧4h，随炉冷却到室温后再次研磨，得到多种组分的bi2wo6-re样品。具体包括获得er³⁺、yb³⁺双掺的bi2wo6粉体，tm³⁺、yb³⁺双稀土掺杂bi2wo6粉体及er³⁺、tm³⁺、yb³⁺多种稀土掺杂的钨酸铋粉体，这三种样品分别标记为bwo-31、bwo-32、bwo-33。未掺杂稀土的样品标记为bwo。

步骤(2)制备n掺杂的gqds

先将2g前驱物芘与80ml发烟硝酸混合后，在80℃下回流搅拌，将芘晶粒表面进行硝基功能化处理，取出反应物后过滤除酸后加入适量的氨水调节ph值，采用300w超声波分散处理后转移至聚四氟乙烯罐中，在180℃下水热反应10h，待自然冷却后取出反应物过滤透析后在70℃下干燥得到n-gqds。

步骤(3)gqds-vdna偶联物的制备

将720μlgqds用100μl含有10mmedc和10mmnhs的水溶液在室温下活化30min，然后将600μl2μm过量的vp适配体vdna加入到上述gqds溶液中，持续搅拌过夜。所得溶液在4℃离心除去过量vdna，即得到gqds-vdna偶联物。

步骤(4)构建检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器工作电极

将fto电极先后用丙酮、氢氧化钠、去离子水清洗，烘干备用。将10mgbi2wo6-re超声溶解于5ml水中，取20μl均匀溶液滴于面积为0.25cm²的fto电极上，自然晾干后，450℃空气气氛下煅烧30min，自然冷却至室温。再将fto/bi2wo6-re电极浸入0.01mhaucl4(ph＝4.5)溶液中40min，于300℃下煅烧2h形成金纳米颗粒，即得fto/bi2wo6-re/au电极。

将20μl在三(2-羧乙基)膦(tcep)(0.5μl，10mm)溶液中活化1h的2μmvp适配体vdna的互补dna(sdna)滴在fto/bi2wo6-re/au电极上，在4℃下孵化过夜。用tris-hcl(ph＝7.4，10mm)缓冲液冲洗除去未连接的sdna，然后用20μl6-羟基-1-己硫醇(mch)封闭1h。tris-hcl冲洗后，将20μlgqds-vdna偶联物滴在电极上，并在37℃下孵育1h使sdna与vdna杂交。用tris-hcl溶液冲洗后，在适配体电极上滴加20μl不同浓度含20uexo-i的vp溶液，孵育1h，用tris-hcl溶液冲洗后即得检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器工作电极。

步骤(5)构建检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器

将步骤(4)制备的光电化学生物传感器工作电极插入光电化学池中，再将饱和甘汞电极和铂对电极插入，组成三电极体系，外接电化学工作站，辅以模拟日光氙灯光源系统(加装了am1.5太阳光谱模拟滤光片，可量化，具有标准性)，即组装成了光电化学适配体传感器，用于副溶血性弧菌的光电化学检测。

光电化学灵敏性检测

基于以上检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器进行光电化学灵敏性检测

将上述构建的副溶血性弧菌光电化学适配体传感器用于副溶血性弧菌的灵敏性检测，步骤如下：

(1)配制不同浓度梯度的副溶血性弧菌菌液；浓度分别为10cfu/ml、100cfu/ml、10³cfu/ml、10⁴cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁸cfu/ml。

(2)取步骤(1)所配制的副溶血性弧菌菌液滴加至工作电极表面；

(3)光电化学检测在室温下含有0.1m抗坏血酸(aa)的tris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4，0.1m)中进行，aa在光电流响应测试中作为电子供体。测试过程中由模拟日光氙灯光源系统产生光源，每10s开/关光源一次。光电系统外加电压为0.0v。在光电流响应测试前，向aa溶液通n2除氧15min。

根究i-t图像绘制标准曲线，如图5所示，中图5(a)为滴加不同浓度副溶血性弧菌菌液的光电流图，自上而下vp浓度依次增加，从图中可以看出滴加vp浓度越大，光电流越低，，图5(b)为拟合的标准曲线图，得到的线性关系公式为y＝-4×10^-6x+6×10^-5r²＝0.9913，因此，副溶血性弧菌的线性检测范围为10-10⁸cfu/ml，检测限为10cfu/ml。

特异性实验

将上述所制备的副溶血性弧菌适配体传感器用于特异性实验：将步骤(2)的滴加副溶血性弧菌，改为滴加无菌水、大肠杆菌菌液、单增李斯特菌液、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌液，如图6所示，图中图例自左向右分别为：a为副溶血性弧菌，b为空白，c为大肠杆菌，d单增李斯特菌，e为沙门氏菌，f为金黄色葡萄球菌。实验结果表明，除了副溶血性弧菌以外，其他菌液不会对光电流产生明显变化。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。