基于纳米酶的膀胱癌BTA检测试纸条的制作方法

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种基于纳米酶的膀胱癌bta检测试纸条。

背景技术：

磁性纳米颗粒具有良好的生物相容性，其既具有纳米材料所特有的性质，如粒径小、比表面积大、偶联容量高，又具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热，利用这些特性，磁性纳米颗粒被广泛应用于磁共振对比剂、磁靶向药物载体、细胞与生物分子分离、生物传感与检测以及磁感应肿瘤热疗等生物学领域。

磁性免疫层析(magneticimmunochromatographictest，mict)作为一种新一代单人份快速定量检测技术逐渐发展起来，它是以超顺磁性纳米颗粒代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，最后通过磁信号阅读仪读取结合在检测线处磁颗粒的磁场强度，从而对所检样品进行定性定量判断。

纳米酶bta检测试纸条的工作原理，是将能特异识别bta的抗体固定在硝酸纤维素膜(nc膜)上作为检测线(t线)，将能特异识别bta的另一抗体(鼠源或兔源)固定在纳米酶上得到纳米酶探针，将羊抗鼠或羊抗兔(视纳米酶上的抗体而定)抗体固定在nc膜上作为质控线(c线)。

当待测样品(如尿液)与纳米酶探针混合后，纳米酶探针上的抗体分子与待测样品中的bta发生抗原抗体反应而形成纳米酶bta复合物，然后利用纳米酶的磁性，将待测样本中的bta分子进行富集，加入到96孔板的小孔中，接下来将纳米酶bta检测试纸条插入，液体在吸水垫的作用下层析，当纳米酶bta复合物层析到nc膜上的t线位置时，bta与t线上的抗bta抗体再一次发生抗原抗体反应而被捕获，由于纳米酶自身具有棕色因而能够在t线的位置显示条带，条带的深浅与待测液体中bta的多少呈正相关。

无论待测样品中是否有bta分子，当纳米酶探针层析到nc膜上的c线位置时，此处固定的羊抗鼠或羊抗兔抗体都能与纳米酶探针上的鼠源或兔源抗体结合将其捕获，从而显示条带，以指示纳米酶探针和nc膜上的抗体分子均正常有效，达到了质控的目的。

技术实现要素：

本发明首先涉及一种基于纳米酶的磁性和过氧化物酶活性的bta抗原检测试纸条，所述的试纸条上装有检测线，质控线。

本发明还涉及一种基于纳米酶的磁性和过氧化物酶活性的bta抗原检测试纸条的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)包被膜的制备：用包被缓冲液将bta的抗体、二抗分别稀释，使用定量喷膜装置按前后顺序将二者均匀喷印于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线(t线)抗体带与质控线(c线)抗体带；

(2)磁颗粒探针垫的制备：使用喷膜仪将处理好的磁颗粒探针均匀喷涂于玻璃纤维垫上；

(3)样品垫的处理：将样品垫浸入样品垫处理液处理、烘干。

(4)试纸条的组装及切割：将包被膜、磁颗粒探针垫、样品垫、吸水垫以相互交错的形式依次粘贴在背衬(底板)上，覆膜并组装成试纸板。

所述的bta抗原(膀胱癌抗原，即人补体因子h相关蛋白)氨基酸序列如seqidno.1所示：

seqidno.1：

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本发明的有益效果在于：纳米酶bta(膀胱癌抗原)检测试纸条同时利用了纳米酶的磁性和过氧化物酶活性，具体如下：

一次尿液50ml，纳米酶富集后用500μl缓冲液重悬，起到了核酸浓缩100倍的作用；

层析结束后，利用纳米酶的过氧化物酶活性，加入显色液进行信号放大，起到了灵敏度5倍提高的作用。

此为纳米酶首次应用于尿液检测，尿液检测有样本量大的特点，因此两者的综合效果可实现灵敏度500倍的提高。

附图说明

图1、检测尿液中目标物质成分的纳米酶检测试纸条结构示意图。

具体实施方式

实施例1，检测bta抗原的纳米酶试纸条的制备

检测线，质控线的位置如图1所示，各个位置上的预装检测物如下：

1、包被膜的制备：用包被缓冲液(0.02m磷酸盐缓冲液，ph7.2)将bta的抗体、市售羊抗鼠抗体(二抗)分别稀释为0.5mg/ml与1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量按前后顺序将二者以0.8cm的间隔均匀喷印于3.5cm宽度的硝酸纤维素膜上，分别形成检测线(t线)抗体带与质控线(c线)抗体带。室温晾干30min后于封闭液(含有0.5％bsa的0.02mpbs，ph7.2)中浸泡10min后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

2、磁颗粒探针垫的制备：使用喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒探针以50μl/cm的量均匀喷涂于0.8cm宽度的玻璃纤维垫上，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用。

3、样品垫的处理：将1.8cm宽度的样品垫(亲水性的玻璃纤维)浸入样品垫处理液(1-5％casein(酪蛋白)，0.1-1％pva(聚乙烯醇)，0.01-0.2％tween20，0.02mpbs，ph7.2)处理1小时，取出后于25-35℃烘干8小时。

4、试纸条的组装及切割：将3.5cm包被膜、0.8cm磁颗粒探针垫、1.8cm样品垫、2.5cm吸水垫以相互交错2mm的形式依次粘贴在背衬(底板)上，覆盖一层透明塑料密封膜，组装成试纸板；使用切条机将组装好的试纸板切成0.5cm宽的成品试纸条；将切割好的试纸条置于塑料低卡上的卡槽内，盖上上盖，使用压卡机将上下两片塑料卡压紧，加入干燥剂室温封存备用。

bta(膀胱癌抗原，即人补体因子h相关蛋白)氨基酸序列如seqidno.1所示：

seqidno.1：

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实施例2，检测bta抗原

1、加样检测

微量移液器取50μl含有梯度浓度的bta样品溶液(浓度依次是100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0ng/ml)加入检测卡上的样品垫上，再加入50μl层析缓冲液(1％tween20，0.5％tritonx-100，1％np-40，0.05％nan3，20mmpbs，ph7.2)，等待反应进行15min。由于磁颗粒上偶联有bta的另一个配对单抗，它与样品溶液中的bta结合后形成的复合物继续先前移动时，会与检测线(t线)处的bta的另一抗体结合形成磁颗粒的聚集，而没有结合的bta的磁颗粒抗体探针会继续移动到质控线(c线)处通过与其二抗作用形成磁颗粒的聚集。

2、酶催化放大检测信号

在检测线t线和质控线c线处加入50μl的显色溶液(过氧化氢h2o2，浓度为530mm；过氧化物酶的生色底物二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine，dab)浓度为816mm)，反应5min。

由于磁颗粒的过氧化物模拟酶活性，会在磁颗粒聚集的t线和c线处生成大量棕褐色的不溶性沉淀物，从而将检测信号放大，其检测灵敏度是传统胶体金试纸条检测法的500倍以上。

以上仅是本发明的具体应用范例。应理解，这些实施例仅用于说明本专利而不用于限制本发明的范围。

sequencelisting

<110>深圳市第二人民医院

中国科学院生物物理研究所

<120>基于纳米酶的膀胱癌bta检测试纸条

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