一种幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及化学发光体外诊断
技术领域：
，具体涉及一种幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：幽门螺旋杆菌(helicobacrerpylori，hp)是一种寄生在胃部和十二指肠的革兰式阴性微量需氧细菌，其感染非常普遍，全球自然人群感染超过50％。几乎所有的幽门螺旋杆菌感染者在组织学上均存在慢性活动性炎性反应，最新的专家共识将hp胃炎明确为“一种感染(传染)性疾病”，但其中约70％以上感染者无症状，其他可导致慢性胃炎、消化性溃疡等。研究表明幽门螺旋杆菌是胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，并且与功能性消化不良、胃粘膜相关性淋巴组织(malt)淋巴瘤、胃癌的发生密切相关、世界卫生组织国际癌症研究机构已将其纳入一类致癌因子。有关幽门螺旋杆菌感染的国际指南中指出，根除幽门螺旋杆菌可显著减少胃和十二指肠疾病包括胃癌的发病率，并可在未来减少幽门螺旋杆菌感染的新发病例。幽门螺旋杆菌的诊断方法依据取材有无创伤性分为两大类：侵入性检测方法和非侵入性检测方法。前者是指依赖胃镜取材的检测方法，包括组织学检测(如he染色、warthin-starry银染、改良giemsa染色、甲苯胺蓝染色等)、细菌培养和快速尿素酶试验(rut)等；后者则包括血清学(抗体)检测、粪便抗原检测和尿素呼气试验(ubt)等。不同的诊断方法有各自的优势和局限性。目前市场上应用的幽门螺旋杆菌检测方法主要是酶联免疫吸附法。酶联免疫吸附法包括：酶标板，酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述的固相载体上设置多个微孔，包被层附着在固相载体的微孔表面，包被层是由幽门螺旋杆菌抗体和牛血清白蛋白依次涂布在固相载体的微孔表面形成的复合层，通常采用tmb为显色底物。反应过程中，待测物与生物素化的幽门螺旋杆菌抗体结合在酶标板上，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(hrp)放大信息，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tmb)及硫酸分别作为底物及终止液，完成检测。这种方法的缺点是：(1)以酶标板作为固相载体时，由于载体表面的检测物与样品中的待测物无法充分接触，导致反应效率较低，反应时间较长，通常在60min以上，有些甚至达到3小时以上。(2)由于酶的生物活性会随着环境条件(温度、ph等)发生变化，导致同样数量的酶在不同条件下产生的光量有明显的区别，无法得到稳定的结果。技术实现要素：本发明要解决现有幽门螺旋杆菌检测方法存在测试耗时长，重复性差，稳定性差，灵敏度差，准确度差的技术问题，提供一种高效率、高稳定性的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：本发明提供一种幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：r1试剂、r2试剂、r3试剂、校准品、质控品；所述r1试剂为链霉亲和素磁微粒溶液；所述r2试剂为化学发光物质标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液；所述r3试剂为生物素标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液。在上述技术方案中，优选的是，所述链霉亲和素磁微粒溶液浓度≥0.03％，所述生物素标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液浓度≥0.1μg/ml，所述化学发光物质标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液浓度≥0.1μg/ml。在上述技术方案中，优选的是，链霉亲和素磁微粒的粒径为1～3μm。在上述技术方案中，优选的是，化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物；生物素为长链磺化生物素sulfo-nhs-lc-biotin。在上述技术方案中，优选的是，所述生物素标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液中，生物素与抗体的摩尔比为1：1～20：1。在上述技术方案中，优选的是，所述化学发光物质标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液中，化学发光物质与抗体的摩尔比为1：1～10：1。在上述技术方案中，优选的是，幽门螺旋杆菌校准品浓度为10～50ng/dl，体积为1ml；幽门螺旋杆菌质控品浓度为10～50ng/dl，体积为1ml。本发明还提供一种幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：步骤1、r1试剂制备：取链霉亲和素磁颗粒溶液加入tbst溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液ⅰ清洗三次，清洗后，再用缓冲液ⅰ配成链霉亲和素磁微粒溶液的固相试剂，即为r1试剂；步骤2、r2试剂制备：将幽门螺旋杆菌抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入化学发光物质溶液，用离心机室温条件下离心；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器，混匀；然后加入赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器，中速混匀，进行封闭；将封闭好的幽门螺旋杆菌抗体纯化，用pb缓冲液洗脱，分别收集；将收集好的抗体溶液用缓冲液ⅰ稀释后得到化学发光物质标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液，即为r2试剂；步骤3、r3试剂制备：取幽门螺旋杆菌抗体，采tris缓冲液透析纯化后加入已活化的生物素，反应后再转入室温继续反应，最后加入赖氨酸接着反应，反应结束后反应液用脱盐柱纯化，加入缓冲液ⅰ稀释后得到生物素标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液，即为r3试剂；步骤4、制备幽门螺旋杆菌校准品、及幽门螺旋杆菌质控品。在上述技术方案中，优选的是：缓冲液ⅰ由50mm的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的proclin300组成，ph为6.5。在上述技术方案中，优选的是：r2试剂制备中，将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀的时间为4h，封闭反应的时间为1h；r3试剂制备中，加入生物素后先是在2～8℃反应2h，再室温继续反应30min，最后加入赖氨酸反应30min。本发明的有益效果是：本发明的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒具有以下优点：1、使用化学发光法检测幽门螺旋杆菌，检测速度快，重复性好。2、使用生物素-亲和素体系，避免了抗体直接包被磁珠导致的磁珠凝集，解决了稳定性的问题。生物素-亲和素体系是通过链霉亲和素-生物素之间特异性相互作用，将生物素标记的类似物连接到磁微粒上。这一结合过程是在检测样本时发生的，试剂盒在使用之前，链霉亲和素包被的磁珠和生物素标记的抗体是分开存放的，因此可以避免抗体直接结合磁珠导致磁珠的凝集。3、采用吖啶酯直接发光，提高了灵敏度，检测灵敏度＜0.5ng/dl。综上与现有技术相比，本发明的试剂盒具有测试速度快，测试结果重复性好，试剂性能稳定，灵敏度高，测试结果准确等优点。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。图1为幽门螺旋杆菌校准品标准曲线。用迪瑞试剂测试校准品理论浓度为横坐标，光量强度为纵坐标，绘制标准曲线，曲线如图1所示：校准品理论浓度(ng/dl)相对光单位(rlu)0.003445.00176325.00772650.0014960100.0028625500.00139318具体实施方式本发明的发明思想为：本发明为了解决现有产品测试耗时长，重复性差，稳定性差，灵敏度差，准确度差等问题，提供一种高效率、高稳定性的磁微粒化学发光试剂盒。本发明使用生物素-亲和素体系，避免了抗体直接包被磁珠导致的磁珠凝集，解决了稳定性的问题。生物素-亲和素体系是通过链霉亲和素-生物素之间特异性相互作用，将生物素标记的抗体连接到磁微粒上。这一结合过程是在检测样本时发生的，试剂盒在使用之前，链霉亲和素包被的磁珠和生物素标记的抗体是分开存放的，因此可以避免抗体直接结合磁珠导致磁珠的凝集。本发明采用吖啶酯直接发光，提高了灵敏度。本发明所采用的技术方案是：本发明的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：r1试剂、r2试剂、r3试剂、校准品、质控品；所述r1试剂为链霉亲和素磁微粒溶液；所述r2试剂为化学发光物质标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液；所述r3试剂为生物素标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液。优选的是，所述链霉亲和素磁微粒溶液浓度≥0.03％，所述生物素标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液浓度≥0.1μg/ml，所述化学发光物质标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液浓度≥0.1μg/ml。优选的是，链霉亲和素磁微粒的粒径为1～3μm。优选的是，化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物；生物素为长链磺化生物素sulfo-nhs-lc-biotin。优选的是，所述生物素标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液中，生物素与抗体的摩尔比为1：1～20：1。优选的是，所述化学发光物质标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液中，化学发光物质与抗体的摩尔比为1：1～10：1。优选的是，幽门螺旋杆菌校准品浓度为10～50ng/dl，体积为1ml；幽门螺旋杆菌质控品浓度为10～50ng/dl，体积为1ml。本发明的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：步骤1、r1试剂制备：取链霉亲和素磁颗粒溶液加入tbst溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液ⅰ清洗三次，清洗后，再用缓冲液ⅰ配成链霉亲和素磁微粒溶液的固相试剂，即为r1试剂；步骤2、r2试剂制备：将幽门螺旋杆菌抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入化学发光物质溶液，用离心机室温条件下离心；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器，混匀；然后加入赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器，中速混匀，进行封闭；将封闭好的幽门螺旋杆菌抗体纯化，用pb缓冲液洗脱，分别收集；将收集好的抗体溶液用缓冲液ⅰ稀释后得到化学发光物质标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液，即为r2试剂；步骤3、r3试剂制备：取幽门螺旋杆菌抗体，采tris缓冲液透析纯化后加入已活化的生物素，反应后再转入室温继续反应，最后加入赖氨酸接着反应，反应结束后反应液用脱盐柱纯化，加入缓冲液ⅰ稀释后得到生物素标记的幽门螺旋杆菌抗体溶液，即为r3试剂；步骤4、制备幽门螺旋杆菌校准品、及幽门螺旋杆菌质控品。优选的是：缓冲液ⅰ由50mm的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的proclin300组成，ph为6.5。优选的是：r2试剂制备中，将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀的时间为4h，封闭反应的时间为1h；r3试剂制备中，加入生物素后先是在2～8℃反应2h，再室温继续反应30min，最后加入赖氨酸反应30min。本发明的幽门螺旋杆菌的磁微粒化学发光试剂盒用于幽门螺旋杆菌检测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对幽门螺旋杆菌主校准品进行检测，绘制主校准曲线，内置于射频卡；接着测试两点校准，对主校准曲线进行校准；接着测试质控品，质控品测试结果落在靶值范围内认为校准合格。测试实际样本，根据样本相对发光单位(rlu)计算样本中幽门螺旋杆菌的浓度；最后对幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰性)的评价。这种幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成幽门螺旋杆菌的检测。经过实验验证，其检测灵敏度＜0.5ng/dl。此外，这种幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒还具有以下优点：1、使用化学发光法检测幽门螺旋杆菌，检测速度快，重复性好。2、使用生物素-亲和素体系，避免了抗体直接包被磁珠导致的磁珠凝集，解决了稳定性的问题。生物素-亲和素体系是通过链霉亲和素-生物素之间特异性相互作用，将生物素标记的类似物连接到磁微粒上。这一结合过程是在检测样本时发生的，试剂盒在使用之前，链霉亲和素包被的磁珠和生物素标记的抗体是分开存放的，因此可以避免抗体直接结合磁珠导致磁珠的凝集。3、采用吖啶酯直接发光，提高了灵敏度。为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过具体实例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中描述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。以下实施例所用吖啶酯的结构为：所用生物素的结构为实施例1幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒的制备：r1试剂制备：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒(粒径1μm)溶液0.5ml(50mg)加入tbst溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液ⅰ清洗三次，清洗后，再用缓冲液ⅰ配成磁颗粒浓度为0.05％的固相试剂，即为r1试剂，2～8℃保存；r2试剂制备：将500μg幽门螺旋杆菌抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5μl2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心0.5min；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中，混匀4h；加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分别收集；将收集好的抗体溶液用缓冲液ⅰ稀释至终浓度为0.1μg/ml，即为r2试剂，2～8℃保存。r3试剂制备：取0.5μg/ml幽门螺旋杆菌抗体，采用ph为6.5的tris缓冲液透析纯化后加入10倍摩尔比已活化的长链磺化生物素sulfo-nhs-lc-biotin，2～8℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应30min，反应液用脱盐柱纯化，加入缓冲液ⅰ稀释至终浓度为0.1μg/ml。r1、r2和r3试剂中，缓冲液ⅰ由50mm的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的proclin300组成，ph为6.5。配制幽门螺旋杆菌校准品浓度为10～50ng/dl，体积为1ml；幽门螺旋杆菌质控品浓度为10～50ng/dl，体积为1ml。实施例2r1试剂制备：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒(粒径3μm)溶液0.5ml(50mg)加入tbst溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液ⅰ清洗三次，清洗后，再用缓冲液ⅰ配成磁颗粒浓度为1％的固相试剂，即为r1试剂，2～8℃保存；r2试剂制备：将500μg幽门螺旋杆菌抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5μl2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心0.5min；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中，混匀2h；加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分别收集；将收集好的抗体溶液用缓冲液ⅰ稀释至终浓度为0.5μg/ml，即为r2试剂，2～8℃保存。r3试剂制备：取1.5μg/ml幽门螺旋杆菌抗体，采用ph为6.0的tris缓冲液透析纯化后加入20倍摩尔比已活化的长链磺化生物素sulfo-nhs-lc-biotin，2～8℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应30min，反应液用脱盐柱纯化，加入缓冲液ⅰ稀释至终浓度为0.5μg/ml，即为r3试剂。r1、r2和r3试剂中，缓冲液ⅰ由100mmmes、0.05％吐温和0.05％proclin300组成，ph为6.0的缓冲液。幽门螺旋杆菌校准品浓度为10～50ng/dl，体积为1ml；幽门螺旋杆菌质控品浓度为10～50ng/dl，体积为1ml。实施例3幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒性能评价灵敏度的检测：参照clsiep17-a文件推荐实验方案，计算幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒的灵敏度，灵敏度＜0.5ng/dl。线性的检测：对浓度为0.2ng/dl、5.00ng/dl、25.00ng/dl、50.00ng/dl、100.00ng/dl、500.00ng/dl的样本做线性分析，计算线性相关系数，r＝0.9990，另外，该试剂盒的线性范围为0.2-500ng/dl。精密度测定：取浓度为20ng/dl的低浓度幽门螺旋杆菌样品和100ng/dl高浓度幽门螺旋杆菌样品，每个样本每个浓度各做3次平行测试，用3批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均＜15％。干扰性实验：取混合血清分别添加干扰物，包括：胆红素、血红蛋白、甘油三酯、人白蛋白，其中胆红素浓度为30mg/dl，血红蛋白浓度为500mg/dl，甘油三酯浓度为3000mg/dl，人白蛋白浓度为12g/l，分别测定添加干扰物质的血清和未添加干扰物质的血清，计算测试偏差，偏差＜±10％。结果表明，干扰性均达到nccls的文件标准，可用于临床实验室幽门螺旋杆菌状况的准确评估。对实施例1～2的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒的性能进行评价，该幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒的检测步骤如具体实施方式中所述。灵敏度的检测：参照《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》，主校准品a为零浓度校准品，主校准品b为相邻校准品；测试主校准品a，重复20次；测试主校准品b，重复3次，检测结果如表1与表2所示。表1实施例1幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒灵敏度检测表2实施例2幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒灵敏度检测从表1～2可以看出，本发明的试剂盒灵敏度最低检测线分别为0.24ng/dl、0.27ng/dl，灵敏度均小于0.5ng/dl。利用实施例1～2的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒进行线性检测：即将浓度为0.2ng/dl、5.00ng/dl、25.00ng/dl、50.00ng/dl、100.00ng/dl、500.00ng/dl的样本进行检测，检测结果如表3～4所示。表3实施例1的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒线性检测表4实施例2的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒线性检测利用表3～4中数据作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.999，线性范围为0.5-500ng/dl。对实施例1～2的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒进行抗干扰特异性实验，检测结果如表5～6所示。表5实施例1的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒的抗干扰特异性实验表6实施例2的幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒的抗干扰特异性实验从表5～6可以看出，在胆红素30mg/dl、血红蛋白500mg/dl、甘油三酯3000mg/dl、人血清白蛋白12g/l中的的样本，不会显著影响幽门螺旋杆菌含量的测定(±10％)。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12