一种基于电化学晶体管的高通量微孔板药物筛选芯片及其制备方法与流程

本发明属于药物筛选芯片的技术领域，具体涉及一种基于电化学晶体管的的高通量微孔板药物筛选芯片及其制备方法。

背景技术：

近15年来，新药研发的成本从2003年的10亿美元攀升至30亿美元，这导致平均每年仅有30种药物通过美国药审中心新药审批，而药物筛选获得的靶点约500个，不到人类基因组计划预测结果的10%，高昂的药物筛选平台是新药研发成本的重要组成，以nih为例，每台药物筛选机器人成本高达2000万美元。

传统的高通量筛选平台，以微孔板作为实验工具载体，并依赖于光学检测系统实现分子水平或者细胞水平的药物检测，常用的检测方法包括临近闪烁分析法，荧光强度分析法，时间分辨荧光技术等，亦有学者提出基于小分子微阵列的高通量药物筛选平台，如biacore的cm5芯片，该方法首先将蛋白质靶标以共价方式固定在芯片表面，然后小分子药物缓冲液通过微流道达到芯片表面，最终通过表面等离子体共振技术，可以获得药物蛋白作用过程的动力学常数，从而甄别药物候选者（hit），但是这些方法均依赖于昂贵的光学检测系统。

技术实现要素：

本发明为了克服现有技术中存在的不足，所要解决的技术问题为：提供一种基于电化学晶体管的高通量微孔板药物筛选芯片及其制备方法；为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于电化学晶体管的高通量微孔板药物筛选芯片，包括三层结构，从顶层到底层依次为pcb板、通孔层以及基片；

所述pcb板上焊接有多段结构相同的金属丝、多个pcb板矩形焊盘、多个pcb板圆形焊盘；

所述金属丝插入对应的pcb板圆形焊盘并用焊锡固定，所述pcb板圆形焊盘通过pcb板表面的引线与pcb板矩形焊盘相连；

所述通孔层上设置有多个圆形通孔；

所述基片上设置有多个基片pad、微电极阵列以及多条引线，所述微电极阵列通过引线与基片pad相连；

所述微电极包括三个微电极，具体为oect的源极、漏极和栅极；所述源极和漏极之间还沉积有一层有机半导体膜作为oect的沟道层。

所述基片的结构为：

所述基片包括基底，所述基底的上层沉积有第一金属层，所述第一金属层内部设置有电气连接线和基片pad；所述第一金属层上层还设置有沉积绝缘层，所述沉积绝缘层上设置有电极窗口通孔；所述沉积绝缘层上还沉积有第二金属层，所述第二金属层流入电极窗口通孔并与第一金属层接触。

所述金属丝具体由金、铂或钯材料制作，所述pcb板矩形焊盘、pcb板圆形焊盘以及引线具体由铜材料制作；

所述pcb板矩形焊盘用于连接外部监测电路，所述pcb板圆形焊盘用于焊接金属丝；

所述通孔层具体为固化型聚合物，或为热塑性聚合物，或为溶剂挥发型聚合物。

所述通孔层由3d打印技术和模塑工艺制备得到多个圆形通孔，所述圆形通孔的数量和尺寸与微电极阵列的分布与尺寸相适应。

所述微电极阵列通过引线层连接到基片pad，使每一个微电极对应一个基片pad，所述引线层内部设置的引线之间相互不交叉，所述基片pad等间隔分布在基片的两侧；

所述微电极阵列、基片pad具体由金、钯、铂材料制作；

所述引线层内设置的引线具体由钛、金、铝材料制作。

一种基于电化学晶体管的高通量微孔板药物筛选芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：根据pcb图纸制作pcb板，将金属丝焊接到对应的焊盘上；

步骤二：通过mems工艺制备得到基片，具体步骤为：

步骤2.1：选用二氧化硅或者玻璃作为基底，将基底浸泡于铬酸24小时，并用去离子水清洗，并烘干备用；在基底上沉积第一层金属层并通过光刻和lift-off工艺，形成用于引出各个电极的电气连接线以及基片pad；

步骤2.2：沉积绝缘层并刻蚀，形成电极窗口通孔；采用pecvd再生长厚度为100~300nm的二氧化硅绝缘层，并使用光刻版进行曝光，并用氢氟酸与氟化铵的混合溶液腐蚀绝缘层，形成一个和微电极阵列以及基片pad重合的窗口；

步骤2.3：沉积第二金属层并通过光刻和lift-off工艺，形成电极图案，钛层厚度为20~50nm，金层厚度为300~500nm；

步骤三：生长有机半导体膜：

步骤3.1：将步骤二得到的基片放置在事先设计好的临时pcb板上，把基片上的焊盘和临时pcb板上的焊盘对应连接；

步骤3.2：在连接好导线的基片上滴加电解液，在需要生长有机半导体膜的临时pcb板电极间施加的交流电可以是正弦波电压、方波电压、三角波电压，也可以为偏置电压，电压幅值为1v～15v，频率为10hz～1mhz，用显微镜观察有机半导体的生长状况；

步骤3.3：生长完毕，用去离子水冲洗基片3~10遍；

步骤3.4：在干燥箱中80~100℃干燥3~5min；

步骤四：利用3d打印技术和模塑工艺加工通孔层：

步骤4.1：使用solidworks设计用于制作圆形通孔的模型图纸并输入到3d打印机制作通孔层模型；

步骤4.2：使用锡纸制作跟模型大小相似的容器，将制作完毕的模型放置在容器中；倾倒适量的pdms，pdms层的厚度为4~7mm；

步骤4.3：将上述容器转移到真空干燥箱中，抽真空5min，以除去pdms中残留的气泡，然后在干燥箱中70~90℃干燥1小时，以固化pdms；

步骤4.4：将固化后的pdms从模型上取下，用手术刀将其切成需要的大小；

步骤五：将步骤二中制备好的基片在蛋白点样机上进行点样，点样方式可以采用接触式的针点点样方式，或者非接触式的喷点点样方式；

步骤六：将通孔层和基片用螺栓机械键合在一起，使用微孔板加液器给每个圆形微池都加入适量的待测药物，把pcb板放置在通孔层上；将基片、通孔层、pcb板与外部测量电路连接完毕；以金属丝为栅极，扫描栅极电压，并通过用单片机测量oect源漏极间电流的变化就可以判断出蛋白和药物是否发生特异性结合；测量完毕后，拆卸螺母将基片和通孔层分别用去离子水冲洗。

所述步骤三中，生长有机半导体膜也可以采用以下步骤：

步骤3.1：将步骤二得到的基片放置在实现设计好的用于生长有机半导体膜容器中；

步骤3.2：给容器两端的驱动电极上，施加的交流电可以是正弦波电压、方波电压、三角波电压，也可以为偏置电压，其幅值为1v～20v，频率为10hz～1mhz，用显微镜观察有机半导体的生长状况；

步骤3.3：通电3~5min，取出基片，用去离子水冲洗3~10遍；

步骤3.4：在干燥箱中80~100℃干燥3~5min。

所述步骤2.1的具体步骤为：

选用二氧化硅或者玻璃作为基底，将基底浸泡于铬酸24小时，并用去离子水清洗，并烘干备用；然后匀胶并烘干，使用掩膜版进行光刻显影；然后溅射厚度为20~50nm的钛或铬作为玻璃片与金属的粘附层，再溅射厚度为200~400nm的金，完成lift-off，实现导线层的图形化，形成用于引出各个电极的电气连接线导线层以及基片pad。

所述pcb板和通孔层可以重复使用，所述基片经过清洗后，重复步骤三、步骤四也可以实现重复使用的目的，然后重复步骤5即可进行下一次筛选药物实验。

本发明相对于现有技术具备的有益效果为：本发明基于场效应晶体管的信号放大原理，提出了一种以微孔板为载体，以有机电化学晶体管（oect）为检测单元的药物筛选芯片及其制备方法，该芯片通过监测oect源极、漏极之间电流来分析药物蛋白作用产生的栅极电压响应，可以进一步提高药物筛选的通量、降低药物筛选平台的成本。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步说明：

图1为本发明oect微孔板药物筛选芯片的结构示意图；

图2为本发明微电极阵列的结构示意图；

图3为本发明基片的结构示意图；

图4为本发明通孔层的结构示意图；

图5为本发明利用mems工艺制备基片的示意图；

图6为本发明生长有机半导体膜装置的示意图；

图中：1为pcb板、2为通孔层、3为基片、4为pcb板矩形焊盘、5为pcb板圆形焊盘、6为金属丝、7为圆形通孔、8为基片pad、9为微电极、10为引线层；

21为源极、22为漏极、23为有机半导体膜、24为栅极；

31为基底、32为第一金属层、33为沉积绝缘层、34为电极窗口通孔、35为第二金属层。

具体实施方式1

如图1所示为一种基于电化学晶体管的高通量微孔板药物筛选芯片结构图，从上到下依次为pcb板（1）、通孔层（2）、基片（3），本实施方式将以图1所示的芯片，进一步描述芯片的具体制备过程：

所述pcb板（1）上设置有40个矩形铜焊盘，40个圆形焊盘，40段完全一致的铂丝，铂丝通过焊锡焊接到圆形焊盘上，所述圆形焊盘的背面通过引线连接到矩形焊盘。

所述通孔层（2）上设置有40个贯穿该层的圆形通孔7，半径为3mm，通孔之间的距离为9mm，与常见96微孔板尺寸一致。

所述基片（3）上设置有40对微电极，每个微电极中间生长有pedot薄膜，所述微电极阵列中的每一个微电极通过引线连接到相应的矩形铜焊盘上。

上述焊盘、铂丝、通孔的数量不仅限于本实施实例，其数量可以根据具体需求进行增加或减少。

本发明基于oect的高通量微孔板药物筛选芯片制作方法，包括以下步骤：

步骤一：制备pcb板（1），具体为：

（1）用altiumdesigner软件设计pcb图纸并提交给pcb生产厂家；

（2）将直径为0.5mm，长度为4mm的铂丝焊接到pcb板（1）上；

步骤二：通过mems工艺制备得到基片（3），具体为：

（1）如图5所示，选用石英玻璃31作为基底，将基底浸泡于铬酸24小时，并用去离子水清洗，并烘干备用；在基片（3）上沉积第一金属层32并通过光刻和lift-off工艺，形成用于引出各个电极的电气连接线引线层10及基片pad8以及焊盘；

更具体的，首先在玻璃片上匀胶并烘干，使用掩膜版进行光刻显影；然后溅射厚度为30nm的钛（ti）作为玻璃片与金属的粘附层，再溅射厚度为200nm的金（au）；最后，完成lift-off，实现导线层的图形化。

（2）如图5所示，沉积绝缘层33并刻蚀，形成电极窗口通孔34；具体地，采用pecvd再生长厚度为200nm的二氧化硅绝缘层，并使用光刻版进行曝光，并用氢氟酸和氟化铵混合溶液腐蚀绝缘层，形成和微电极9以及基片pad8重合的窗口。

（3）如图5所示，沉积第二金属层35并通过光刻和lift-off工艺，形成矩形焊盘微电极，ti/au层厚度分别为30nm/500nm；cr/au层厚度分别为30nm/500nm；

微电极结构如图2所示，其中序号21、22为两个尖端相对的微电极。

制备得到的基片（3）结构包括引线导线层与焊盘pad，如图3所示：其中41为矩形焊盘，42为基片（3）上对应微电极阵列的引线端子，43为引线。

步骤三：生长有机半导体膜23。

制备得到的pedot膜如图2所示，其中23为pedot膜。

如图6所示为生长有机半导体膜23装置的结构示意图。其中，61为两个驱动电极，62为上述步骤制备的基片（3），63为电解质溶液，64为信号发生器输出的交流电压信号：

上述电解质溶液配制的具体步骤为：0.03g的pss（聚苯乙烯磺酸钠），以及0.14g的edot（3,4，乙烯二氧噻吩）加入去离子水中定容至10ml，40℃水浴加热搅拌1小时，直至pss和edot完全溶解；

本实例中制备有机半导体膜23的具体步骤为：

（1）将制备完毕的基片（3）转移到盛有上述电解质溶液的电化学反应池中；

（2）使用信号发生器，在两侧的电极上施加频率为50hz，幅值为15v的方波电压1min；

（3）切断电源，取出基片（3）用去离子水冲洗残留在基片（3）表面的电解液。

步骤四：利用3d打印技术和模塑工艺加工通孔层（2）：

制备得到的通孔层（2）示意图如图5所示，圆形通孔7半径为3mm，通孔之间的距离为9mm，制备步骤具体为：

（1）使用solidworks设计用于制作圆形通孔7的模型图纸；

（2）将模型图纸输入到3d打印机，制作模型；

（3）使用锡纸制作跟模型大小相似的容器，将制作完毕的模型放置在容器中；倾倒适量配置完毕的pdms，pdms层的厚度为5mm；

（5）将上述容器转移到真空干燥箱中，抽真空5min，以除去pdms中残留的气泡，然后在干燥箱中80℃干燥1小时，以固化pdms；

（6）将固化后的pdms从模型上取下，用手术刀将其切成需要的大小。

步骤五：将步骤3中制备好的基底3在蛋白点样机上进行点样，点样方式可以采用接触式(针点)点样或者非接触式(喷点)点样技术。本实施方式采用非接触式点样技术，使用型号为biodotad1500的蛋白点样机实现点样。不同微电极9阵列之间的有机半导体膜上使用不同的蛋白；

步骤六：将点样完毕的基片3和通孔层2使用螺母机械键合在一起，并放置在微孔板加液器上，使用eppendorfepmotion96给每个圆形微池都加入85μl的待测药物。然后把焊有金属丝6的pcb板1放置在通孔层2上部，使得金属丝6和药物充分接触；最后，将基片3、通孔层2、pcb板1使用螺母机械键合在一起。将上述步骤制备好的芯片（包括基片（3）、通孔层（2）和pcb板（1）与外部测量电路连接。通过用单片机测量oect栅极电压的变化就可以判断出蛋白和药物是否发生特异性结合。测量完毕，拆卸螺母将基片（3）和pcb板（1）分别用去离子水冲洗。本发明中基片（3）和pcb板（1）经过冲洗后就可以重复使用。对于基片（3），需要将其表面的pedot薄膜和蛋白擦洗干净，然后重复步骤3、4就可以实现重复使用的目的；最后，重复步骤5就可以进行下一次筛药实验。

具体实施方式2

如图1所示为一种基于电化学晶体管的高通量微孔板药物筛选芯片结构图，从上到下依次为pcb板（1）、通孔层（2）、基片（3），本实施方式将以图1所示的芯片，进一步描述芯片的具体制备过程：

所述pcb板（1）上设置有40个矩形铜焊盘，40个圆形焊盘，40段完全一致的铂丝，铂丝通过焊锡焊接到圆形焊盘上，所述圆形焊盘的背面通过引线连接到矩形焊盘。

所述通孔层（2）上设置有40个贯穿该层的圆形通孔（7），半径为3mm，通孔之间的距离为9mm与常见96微孔板尺寸一致。

所述基片（3）上设置有40对微电极，每个微电极中间生长有pedot薄膜，所述微电极阵列中的每一个微电极通过引线连接到相应的矩形铜焊盘上。

上述焊盘、铂丝、通孔的数量不仅限于本实施实例，其数量可以根据具体需求进行增加或减少。

本发明基于oect的高通量微孔板药物筛选芯片制作方法，包括以下步骤：

步骤一：制备pcb板（1），具体为：

（1）用altiumdesigner软件设计pcb图纸并提交给pcb生产厂家；

（2）将直径为0.5mm，长度为4mm的铂丝焊接到pcb上；

步骤二：通过mems工艺制备得到基片（3），具体为：

（1）如图5所示，选用石英玻璃31作为基底，将基底浸泡于铬酸24小时，并用去离子水清洗，并烘干备用；在基底（31）上沉积第一金属层32并通过光刻和lift-off工艺，形成用于引出各个电极的电气连接线引线层10及基片pad8以及焊盘；

更具体的，首先在玻璃片上匀胶并烘干，使用掩膜版进行光刻显影；然后溅射厚度为30nm的钛（ti）作为玻璃片与金属的粘附层，再溅射厚度为200nm的金（au）；最后，完成lift-off，实现导线层的图形化。

（2）如图5所示，沉积绝缘层33并刻蚀，形成电极窗口通孔34；具体地，采用pecvd生长厚度为200nm的二氧化硅绝缘层，并使用光刻版进行曝光，并用氢氟酸和氟化铵混合溶液腐蚀绝缘层，形成和微电极9以及基片pad8重合的窗口。

（3）如图5所示，沉积第二金属层35并通过光刻和lift-off工艺，形成矩形焊盘微电极，ti/au层厚度分别为30nm/500nm；cr/au层厚度分别为30nm/500nm；

微电极结构如图2所示，其中序号21、22为两个尖端相对的微电极。

制备得到的基片（3）结构包括引线导线层与焊盘pad，如图3所示：其中41为矩形焊盘，42为基片（3）上对应微电极阵列的引线端子，43为引线。

步骤三：生长有机半导体膜23。

制备得到的pedot膜如图2所示，其中23为pedot膜。

上述电解质溶液配制的具体步骤为：0.03g的pss（聚苯乙烯磺酸钠），以及0.14g的edot（3,4，乙烯二氧噻吩）加入去离子水中定容至10ml，40℃水浴加热搅拌1小时，直至pss和edot完全溶解；

本实例中制备有机半导体膜23的具体步骤为：

（1）使用金丝球焊机将基片（3）上的焊盘与制备有机半导体的临时pcb板（1）上的焊盘对应连接；

（2）将上述电解液滴加在基片（3）上；

（3）使用信号发生器，在生长电极上施加频率为20khz，幅值为4v的方波电压1min；

（4）切断电源，取下基片（3）用去离子水冲洗残留在基片（3）表面的电解液。

步骤四：利用3d打印技术和模塑工艺加工通孔层（2）：

制备得到的通孔层（2）示意图如图5所示，圆形通孔7半径为3mm，通孔之间的距离为9mm，制备步骤具体为：

（1）使用solidworks设计用于制作圆形通孔的模型图纸；

（2）将模型图纸输入到3d打印机，制作模型；

（3）使用锡纸制作跟模型大小相似的容器，将制作完毕的模型放置在容器中；倾倒适量配置完毕的pdms，pdms层的厚度为5mm；

（5）将上述容器转移到真空干燥箱中，抽真空5min，以除去pdms中残留的气泡，然后在干燥箱中80℃干燥1小时，以固化pdms；

（6）将固化后的pdms从模型上取下，用手术刀将其切成需要的大小。

步骤五：将步骤3中制备好的基底3在蛋白点样机上进行点样，点样方式可以采用接触式(针点)点样或者非接触式(喷点)点样技术。本实施方式采用非接触式点样技术，使用型号为biodotad1500的蛋白点样机实现点样。不同微电极9阵列之间的有机半导体膜上使用不同的蛋白；

步骤六：将点样完毕的基片3和通孔层2使用螺母机械键合在一起，并放置在微孔板加液器上，使用eppendorfepmotion96给每个圆形微池都加入85μl的待测药物。然后把焊有金属丝6的pcb板1放置在通孔层2上部，使得金属丝6和药物充分接触；最后，将基片3、通孔层2、pcb板1使用螺母机械键合在一起。将上述步骤制备好的芯片（包括基片（3）、通孔层（2）和pcb板（1）与外部测量电路连接。通过用单片机测量oect栅极电压的变化就可以判断出蛋白和药物是否发生特异性结合。测量完毕，拆卸螺母将基片（3）和pcb板（1）分别用去离子水冲洗。本发明中基片（3）和pcb板（1）经过冲洗后就可以重复使用。对于基片（3），需要将其表面的pedot薄膜和蛋白擦洗干净，然后重复步骤3、4就可以实现重复使用的目的；最后，重复步骤5就可以进行下一次筛药实验。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。