有机物分析的方法及糖异构体的相对定量方法与流程

本发明涉及质谱分析技术领域，特别涉及有机物分析的方法及糖异构体的相对定量方法。

背景技术：

糖类是生物体内非常重要的生物分子，在蛋白质构象、分子识别、细胞增殖和分化等方面发挥着重要的生物学作用。聚糖及其结构的分析与疾病的发生和发展有着密切的关系，因此受到了广泛的关注。然而，由于其固有结构的复杂性，如单糖组成、糖苷键位置、构型构象的差别，对聚糖的分析仍然是一个艰巨的挑战。为了能更好地认识糖基化合物的生物学作用，稳定、高效、高通量的用于糖异构体区分和定量的方法是非常必要的。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms)是近年来(1988年karasetal.和tanakaetal.报道)发展起来的一种新型软电离生有机物谱，其操作简单、灵敏度高、高通量的特性使其得到广泛应用。maldi的原理是用激光照射基质与样品分子形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，将质子传递给生物分子或从生物分子中得到质子，从而实现电离的过程。然而maldi-tofms常用的基质(例如α-腈基-4-羟基肉桂酸(chca)、2,5-二羟基苯甲酸(dhb)等在分析过程中会发生：1)在小分子质量(m/z＜1000)的范围内产生严重的基质背景干扰现象影响聚糖的二级谱图的稳定性和可辨识度2)对糖的低电离效率会影响检测限和分辨率。因此，基质的升级对提升基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法对包括糖在内的有机物分子解析的准确度是有重大意义的。

将纳米材料(纳米金、纳米银、碳点、石墨烯、二氧化钛、氮化钛、硅等)作为基质应用在ldi质谱分析已有多年发展，目前可以分析多种有机化合物。然而，尽管现在已开发的纳米材料基质相对于传统有机基质，已经极大程度地减小了低分子量背景干扰，但仍然存在不足之处，例如在基于蚀刻的多孔硅表面发生解吸/电离时，需要在同样的纳米结构表面上进行反复的处理以得到能重复使用的表面，复杂的制备和昂贵的成本令这一方法难以普及。再者，许多已开发的纳米材料灵敏度不高，检测模式单一，对某种目标分析物如糖的检测效率低也制约着其在糖异构体分析中的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是为解决以上问题，本发明提供一种有机物分析的方法及糖异构体的相对定量方法。

根据本发明的一个方面，提供有机物分析的方法，该方法是以基质辅助激光解析技术作为基础进行质谱分析，该基质辅助激光解析技术的基质包括二维过渡金属碳化物ti3c2。

二维过渡金属碳化物ti3c2(ti3c2mxene)是二维过渡金属碳化物/氮化物(mxenes)材料的一种。mxene材料是采用选择性刻蚀的方法通过刻蚀原本的块体材料max相中的a原子层，削弱了层间的键合作用，再通过插层剥离或者超声辅助液相剥离的方法，将单层的纳米片剥离下来，并且稳定分散在特定溶剂中形成的一种二维纳米片状材料。其中，其前体max相的结构式是mn+1axn)，其中m为过渡金属元素，a为第iiia或者iva元素，x为碳c或者氮n，n是1、2或者3。

其中，该质谱分析方法包括以下步骤：

将二维过渡金属碳化物ti3c2溶于溶剂中，配制成基质溶液；配制待检测样品溶液；将待检测样品溶液与二维过渡金属碳化物ti3c2溶液混合、点样；待样品干燥后，对样品进行质谱分析。

当以二维过渡金属碳化物ti3c2(mxene)为maldi基质时，对基质溶液的浓度没有特别限定，配制成0.5mg/ml至3mg/ml的浓度，经实验证明是可行的。溶剂原则上与质谱后续分析兼容即可，通常可以是水，甲醇，乙醇，乙腈等，包括它们的互溶体系。

其中，待检测样品与基质溶液的混合浓度比为(1-5)mm：(0-1)mg/ml，其中基质溶液的浓度不能为零。

其中，待检测样品溶液的浓度为0.01-1mm，有机物的质荷比介于0-1500之间。

作为一种新兴的超薄二维纳米材料，ti3c2mxene具有独特的性质，例如可调谐的能带宽，高电荷载流子迁移率，比表面积大，亲水性，丰富的高活性表面位点和紫外光吸收能力。经实验发现，二维过渡金属碳化物ti3c2在低质量范围内(m/z：0-1500)背景干扰低，而且可以作为基质对此分子量范围(m/z：0-1500)内的小分子进行高灵敏度的检测。

其中，质谱分析手段包括飞行时间质谱和基质辅助激光解吸电离二级质谱。

其中，该有机物包括氨基酸、脂肪酸、体内小分子代谢物、多肽和聚糖。

其中，该有机物分析包括纯品的识别、混合体的区分、成分鉴定和定量分析。

其中，该混合体为糖异构体，优选地，所述混合体为蜂蜜和糖浆的混合体。

根据本发明的第二方面，提供糖异构体的相对定量方法，包括以下步骤：

采用二维过渡金属碳化物ti3c2作为基质，结合基质辅助激光解吸电离二级质谱作为质量分析手段，分别对双糖溶液、糖异构体a溶液和糖异构体b溶液进行质谱分析。

记录上述三种溶液的二级谱图中特定片碎离子的强度比，分别为rmix、ra和rb；根据公式rmix＝raαa+rbαb，αa/αb＝n×(ca/cb)，制作两种糖异构体的相对定量曲线，其中，αa和αb代表气相中同分异构体a和b的份数，ca代表双糖溶液中糖异构体a的浓度，cb代表双糖溶液中糖异构体b的浓度，n代表α与c之间的固定关系比值。

采用该有机物分析的方法对待定量的双糖溶液进行质谱分析，获取αa待检测/αb待检测数值。

根据αa待检测/αb待检测数值在动态曲线上获取对应的ca待检测/cb待检测数值。

其中，糖异构体a溶液为蜂蜜，糖异构体b溶液为糖浆。

本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明的质谱分析方法，用于检测m/z值在0-1500的分子时，背景干扰低，电离效率高。使用的二维过渡金属碳化物ti3c2基质(ti3c2mxene)可以同时在正离子和负离子两种模式下对不同类型的小分子进行检测，且效果均较好。

2、采用本发明的质谱分析方法对痕量物质进行富集检测实验时，ti3c2mxene由于其具有高表面积和富电子性质，可作为固相微萃取的材料，实现富集检测与辅助解吸电离的双重作用。

3、本发明的质谱分析方法适合分析的样品除了简单的纯品外，还涵盖混合体系。包括但不限于各种生物组织样本、微生物样本、化学合成体系以及环境监测样本；本发明的质谱分析方法对盐耐受度高，利于分析复杂的生物样本。

4、本发明的质谱分析方法，以二维过渡金属碳化物ti3c2(mxene)作为maldi的基质的质谱分析法，通常是用飞行时间质谱(tof-ms)作为质量分析手段，但与其他质谱质量分析器也兼容。

5、本发明的质谱分析方法，待测样品为复杂体系时，通常无需特殊处理，吸取混合体系的上清液(也可以是浑浊液)以一定比例与基质混合，点靶后即可进行质谱分析，且本发明的基质，无需加入离子化试剂，减少了对样本处理的要求。

6、本发明的糖异构体的区分方法，待测样品无需特殊前处理，可直接点样。样品消耗量少只需要1微升，同时具有高通量的优势，可一次性检测384种糖异构体体系。

7、本发明的糖异构体的区分方法，对糖分子的电离效率高，检测限低，没有背景干扰。待测物浓度从0.01mm到1mm之间的二级谱图均十分稳定，没有干扰峰，有助于利用二级谱图进行结构糖异构体结构解析。

8、本发明的分析方法分析糖异构体时，样品分布均匀，没有“咖啡环”效应，增强了二级质谱采集时的可信度，简便了做二级质谱挑选谱图的过程。

9、本发明的糖异构体的区分方法，可以增强maldi源内及源后裂解的效应，在正离子模式下，二级谱图主要由钠离子，糖苷键碎裂碎片和跨环碎裂碎片在内的一系列碎片离子组成。基于某些碎片离子的存在与否以及相对比例的差异，实现了对组成、连接、构型三类糖异构体的快速区分。该方法成功适用于八种二糖，两种三糖和三种七糖。

10、本发明的分析方法，由于糖浆和蜂蜜中的糖类组成结构的差异，立足于ti3c2mxene对实际样品的耐受度，根据蜂蜜中的二糖二级谱图和糖浆的二级谱图差异，我们实现了蜂蜜中非法添加糖浆的快速鉴定。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1示出了根据本发明实施方式的有机物分析的方法的正离子模式下不同的小分子有机物的检测图；

图2示出了根据本发明实施方式的有机物分析的方法的负离子模式下不同的小分子有机物的检测图；

图3示出了根据本发明实施方式的有机物分析的方法的水体污染物(双酚a)的富集前后的maldi-tof质谱图对比；

图4示出了根据本发明实施方式的有机物分析的方法的正离子模式下四种多肽信号耐盐性分析图；

图5示出了根据本发明实施方式的有机物分析的方法的负离子模式下四种多肽信号耐盐性分析图；

图6示出了根据本发明实施方式的有机物分析的方法的正负离子模式下四种氨基酸四种多肽的均匀性分析图；

图7示出了根据本发明实施方式的有机物分析的方法与常用基质的分析方法对寡糖的分析效果对比图；

图8示出了根据本发明实施方式的分析方法对八种二糖异构体的区分结果图；

图9示出了根据本发明实施方式的分析方法对两种三糖异构体的区分结果图；

图10示出了根据本发明实施方式的分析方法对三种七糖异构体的区分结果图；

图11示出了根据本发明实施方式的糖异构体的相对定量方法对二糖异构体的定量图；

图12示出了根据本发明实施方式的糖异构体的相对定量方法对三糖异构体的定量图；

图13示出了根据本发明实施方式的糖异构体的相对定量方法对蜂蜜中添加的糖浆的定量图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

下面将通过具体的实施例的形式对本发明的内容作进一步说明。下列实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的型号为biflextmiii(bruker)和ultraflextreme(bruker)。

实施例1小分子有机物的分析检测

取各种配制好的样品溶液(浓度为1mm)和基质(二维过渡金属碳化物ti3c2mxene)溶液(浓度为3mg/ml)以1：1体积比混合均匀，然后向maldi靶板加入1μl混合样品，空气中干燥后进入质谱分析。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000hz；激光器能量：45-50％；累加次数：200次；正负离子双模式。

在maldi电离方式下，基质可以吸收激光能量转移给待测物使待测化合物电离，负离子模式下形成去质子峰(如图2所示)，正离子模式下呈现加钠或加钾峰(如图1所示)，从而被质谱检测。实验证明，该基质对于以上氨基酸、短肽(gly-tyr、val-tyr-val、tyr-gly-phe-leu、asp-arg-val-tyr-ile-hispro-phe)、有机酸(十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸)、代谢物(肌酐、牛磺酸、次黄嘌呤、n-乙酰天冬氨酸、柠檬酸)等物质均具有较好的分析性能。图1和图2中，待测物的量均为500pmol，可以看出该基质分析灵敏度较高。此外，需要说明的是，除图中所列的化合物外，对图中每一类物质的同类化合物，该基质均可以得到较好的分析结果。

实施例2双酚a(水体污染物)的富集和检测

将双酚a制成浓度为0.5μm的溶液，溶剂为甲醇：水1:1。取100μl待测液与50μl基质溶液混合，摇床中孵育1小时后，离心(10000g)，将沉淀重悬为30μl，取1μl点靶进行质谱测试。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：500hz；激光器能量：45-50％；累加次数：200次；负离子模式。

从图3可以看出，在负离子模式下，不富集时，0.5μm双酚a的信号强度很弱，经过富集之后，信号强度提升超过9倍。因此，该基质可用于水体污染物(双酚a)的检测。

实施例3短肽的耐盐性分析

配置0mm、500mm、1000mm三种浓度的nacl水溶液与四种短肽的水溶液等体积混合，制成nacl浓度梯度为0mm、250mm、500mm的多肽溶液。各取1μl待测液与1μl基质(二维过渡金属碳化物ti3c2mxene)溶液混合。取1μl混合液点在maldi靶板上。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：500hz；激光器能量：45-50％；累加次数：200次；正负离子双模式。

由图4和图5可以看出，在正负两种离子模式下，随着氯化钠浓度的逐渐升高，四种多肽的信号强度没有明显的减弱，这表明ti3c2mxene的耐盐性较强，有利于分析复杂的生物样品。

实施例4四种氨基酸四种多肽的均匀性分析

取配制四种氨基酸、四种多肽样品溶液(浓度为1mm)和基质(二维过渡金属碳化物ti3c2mxene)溶液(浓度为3mg/ml)以1：1体积比混合均匀，然后取1.5μl混合样品点在ito玻璃上，空气中干燥后进入质谱进行成像分析。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：500hz；激光器能量：45-50％；累加次数：250次；分辨率：200μm；正负离子双模式。

从图6可以看出，在正负两种离子模式下，四种氨基酸和四种多肽产生的信号分布均十分均匀，没有明显的“咖啡环”效应。这一效应有利于一二级质谱的稳定。

实施例5ti3c2mxene基质的分析法与常用基质的分析法对寡糖分析对比

配置六种寡糖(葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和α-环糊精)的混合溶液(浓度为1mm)，分别与基质ti3c2mxene(浓度为3mg/ml)、α-腈基-4-羟基肉桂酸(chca)、2,5-二羟基苯甲酸(dhb)以1：1体积比混合均匀,然后取1μl混合样品点在maldi靶板上，空气中干燥后进入质谱分析。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000hz；激光器能量：45-50％；累加次数：200次；正离子模式。

如图7所示，与传统基质α-腈基-4-羟基肉桂酸(chca)、2,5-二羟基苯甲酸(dhb)相比，ti3c2mxene材料显示出没有背景且更强的离子化效率。表明其对糖的优异检测效果。

实施例6八种二糖异构体区分分析

配置八种二糖(麦芽糖、蔗糖、蜜二糖、海藻糖、异麦芽糖、龙胆二糖、异麦芽糖、纤维二糖)溶液(浓度为1mm)和基质(二维过渡金属碳化物ti3c2mxene)溶液(浓度为3mg/ml)以1：1体积比混合均匀，然后取1.5μl混合样品点在maldi靶板上，空气中干燥后进入质谱进行ldi-lift-ms/ms分析，选择的前体离子为m/z365。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：200hz；激光器能量：45-50％；累加次数：1000次；质量选择窗口：2da；正离子模式。

从图8可以看出，在ldi-lift-ms/ms的二级模式下产生了钠离子m/z23、糖苷键碎裂峰m/z23、跨环碎裂峰m/z185、275、305等。根据某些离子的存在与否，如图8a海藻糖只有203没有305,而图8b麦芽糖有305，从而将他们区分。而一些离子之间的比例也可以作为区分依据，如图8em/z203和305的强度比值明显大于3，而图8fm/z203和305的强度比值则小于1。根据这两种区分方法，可以实现对这八种异构体的区分。

实施例7两种三糖异构体的区分分析

配置两种三糖(麦芽三糖和异麦芽三糖)溶液(浓度为1mm)，以及基质(二维过渡金属碳化物ti3c2mxene)溶液(浓度为3mg/ml)以1：1体积比混合均匀，然后取1.5μl混合样品点在maldi靶板上，空气中干燥后进入质谱进行ldi-lift-ms/ms分析，选择的前体离子为m/z527。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：200hz；激光器能量：45-50％；累加次数：1000次；质量选择窗口：2da；正离子模式。

从图9可以看出，类似于实例6的方法，m/z437的存在与否或m/z347和467之间的比值可以作为区分这两种三糖的依据。

实施例8三种七糖异构体的区分分析

配置三种七糖(即a：glcα1-3glcα1-3glcα1-3glcα1-3glcα1-3glcα1-3glc；b：glcα1-4glcα1-4glcα1-4glcα1-4glcα1-4glcα1-4glc；c：glcα1-6glcα1-6glcα1-6glcα1-6glcα1-6glcα1-6glc)溶液(浓度为0.2mm)，以及基质(二维过渡金属碳化物ti3c2mxene)溶液(浓度为3mg/ml)，并以以1：1体积比混合均匀，然后取1.5μl混合样品点在maldi靶板上，空气中干燥后进入质谱进行ldi-lift-ms/ms分析，选择的前体离子为m/z1175。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：200hz；激光器能量：45-50％；累加次数：1000次；质量选择窗口：2da；正离子模式。

由图10可以看出，糖苷键碎裂离子m/z509和527,m/z509和852,m/z672和690,m/z996和1014d额比例差异可以作为区分的标准。同时跨环碎片离子m/z407,437,467,570,600,630,792,954的存在与否和强度也可作为区分依据。

实施例9麦芽糖和海藻糖的定量分析

选择一对二糖异构体麦芽糖和海藻糖，配置七组异构体混合液，浓度相同(1mm)，体积比为1:10,1:5,1:2,1:1,2:1,5:1,10:1。根据七种不同浓度下碎片离子对m/z203和305的比例关系制定相对定量曲线如图11所示。每个点测量六次平行计入统计。

质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：200hz；激光器能量：45-50％；累加次数：1000次；质量选择窗口：2da；正离子模式。

实施例10麦芽三糖和异麦芽三糖的定量分析

选择三糖异构体麦芽三糖和异麦芽三糖，配置七组异构体混合液，浓度相同(1mm)，体积比为1:10,1:5,1:2,1:1,2:1,5:1,10:1。根据七种不同浓度下碎片离子对m/z347和437的比例关系制定相对定量曲线如图12所示。每个点测量六次进入统计。

质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：200hz；激光器能量：45-50％；累加次数：1000次；质量选择窗口：2da；正离子模式。

实施例11蜂蜜中非法添加糖浆的定量分析

配置质量浓度相同的蜂蜜和糖浆(5mg/ml),如图13a所示，蜂蜜和糖浆的二糖的二级谱图有明显差异，比如m/z275在蜂蜜中存在，在糖浆中不存在；同时m/z203和305的比例在蜂蜜和糖浆中的比例也有较大差异，可以作为鉴定依据之一。定量时按体积比为1:10,1:5,1:2,1:1,2:1,5:1,10:1混合配置成7种溶液。根据上述方法制作定量曲线用于相对定量，结果如图13b。

质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：500hz；激光器能量：45-50％；累加次数：200次；负离子模式。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。