一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测方法与流程

本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测。

背景技术：

前列腺癌是男性高发癌症中的一种，到目前为止还没有有效的药物治疗前列腺癌。前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen，psa)，一种有效的生物标记物，不仅可以检测早期的前列腺癌，还可以检测前列腺癌治疗的效果，因此灵敏，准确地检测psa含量十分重要。目前，常见的检测psa的方法主要有荧光，电致化学发光，表面增强拉曼扫描，电化学以及酶联免疫检测等。然而这些方法虽能在一定程度上检测psa的含量，但在一些方面存在限制，例如需要大型的检测装备，检测时间长等。因而发现一种既简便又灵敏的检测psa含量的方法是目前科研工作人员需要解决的问题。

相比较其他检测方法，光电化学检测由于其使用光作为激发信号，检测的是电信号，通过采用不同形式的能量作为激发信号和检测信号，使激发和检测信号互不干扰，因而背景信号较低，可获得较高的灵敏度。而为了更好地实现灵敏检测，如何使检测信号放大，降低背景信号，也成为需要解决的问题。据文献已报道的信号放大策略有酶参与的目标循环放大、基于纳米材料的信号放大、链杂交反应信号放大、旋转滚动放大、树枝状固载信号放大等。tio2-b纳米材料，由于其类似于钙钛矿的结构，拥有相对更多的空隙和连续的通道，使得其具有更高的电子转移能力，光电效应更高。据文献报道，壳聚糖具有模拟酶的特性，在h2o2存在的情况下，可以发生催化反应。

在本发明中，我们将tio2-b与壳聚糖、ag+复合形成复合物tio2-b@cs-ag⁺，再与二抗结合形成标记的二抗，再在h2o2存在的情况下与s2o3^2-反应，原位生成ag2s。由于ag2s的禁带宽度比tio2-b小，当光照射到电极表面，受到光的激发，ag2s价带上的电子向导带转移，形成电子-空穴对，ag2s导带上的电子富集，转移到tio2-b的导带，使得光生电子-空穴复合更慢，光电信号增强。随着待测物浓度的增加，由于免疫反应的发生，固定到电极表面的标记过的二抗浓度相应增加，在h2o2的存在情况下，s2o3^2-发生还原反应生成s^2-与ag⁺结合生成ag2s，增大光电流，根据这一现象可以实现对前列腺抗原的灵敏检测，为临床检测提供了平台。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于原位生成ag2s敏化的tio2-b介观晶体的夹心型光电化学传感器及其制备方法和检测应用。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：

(1)gce的预处理：gce首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；

（2）au/ab1/psa修饰电极的制备：滴加3μl金锥溶液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后将3μl巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰过的电极表面，在4°c下孵育50min，用二次水清洗，去除多余的溶液；将修饰电极于5μl浓度为1mg/ml的前列腺特异性抗原的抗体ab1溶液中4°c下孵育50min，随后使用ph7.4的磷酸缓冲溶液去除多余的前列腺特异性抗原的抗体ab1，再将电极浸入20μl浓度为1.0wt.%的bsa1h，封闭电极表面上非特异性活性位点，用二次水冲去表面残余液后，即得到ab1/au修饰电极；将电极浸入5μl不同前列腺癌细胞抗原（psa）标准溶液中于4°c下孵育50min；用ph7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到au/ab1/psa修饰电极；

（3）au/ab1/psa/ab2/ag2s修饰电极的制备：称取一定量的tio2-b固体粉末，用二次水分散均匀，配制成浓度为3mg/ml的悬浮液，将tio2-b溶液与壳聚糖溶液按照体积比为1:2的比例进行混合，摇匀30min，反应好的溶液在转速为5000rpm的转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入一定量的二次水分散，形成tio2-b@cs溶液。按照agno3溶液与tio2-b@cs体积比为1:1的比例，将一定浓度的agno3溶液加入到tio2-b@cs溶液中，摇匀反应30min，使ag⁺充分吸附到tio2-b表面，通过离心，去除多余的ag⁺，再将固体用二次水分散均匀形成处理过的tio2-b溶液。按照体积比为1:3的比例将前列腺特异性抗原二抗与处理的tio2-b溶液混合，在4°c下反应2h，离心去除未吸附的二抗，用ph为7.4的磷酸缓冲溶液分散，再加入一定量的bsa溶液封闭非活性位点，得到ab2-tio2-b@cs-ag⁺，放置冰箱待用。用移液枪吸取一定量的ab2-tio2-b@cs-ag⁺溶液，滴涂到au/ab1/ag修饰电极，在4°c下孵育1h，用二次水清洗，除去多余的物理吸附，得到au/ab1/psa/ab2电极；在室温下，将0.26m的h2o2与0.18m的s2o3^2-溶液一起滴涂到修饰的au/ab1/psa/ab2电极表面，反应15min，在h2o2与tio2-b@cs的催化作用下，原位生成ag2s，得到au/ab1/psa/ab2/ag2s电极。

上述tio2-b纳米棒材料的制备：

tio2-b纳米棒的制备用钛纳米线作为前驱体通过溶剂热法合成。1gtio2分散到75ml15m的koh水溶液中。摇匀10分钟后，得到的悬浮液转移到100ml的反应釜中，将反应釜放置于170°c下反应72h，然后冷却至室温。得到的沉积物用醋酸溶液清洗直到ph为7.0。最终产物通过离心收集，在60°c的鼓风烘箱中干燥12h。tio2-b的合成，首先将300mg制得的tio2纳米线前驱体分散在50ml浓度为8m的醋酸溶液中，接着将溶液转移到反应釜中，加热到180°c，反应24h。得到的产物通过离心收集，用二次水和乙醇清洗，在60°c下干燥一夜。

上述金锥(auncs)的制备：

在旋涂聚苯乙烯之前，首先将teflon膜切割成1.5cmx1.5cm正方形并用乙醇和二次水冲洗，然后用等离子水清洗3分钟。吸取1ml浓度为2.5w/v%的聚苯乙烯溶液并将其离心，再转移到乙醇和甲醇的体积比为2:1的混合溶液中。在溶液中加入体积比为0.2%的表面活性剂(tx100)，接着将聚苯乙烯的浓度调节至约5w/v%。然后将聚苯乙烯旋涂在清洁的teflon膜上，并在室温下放置几分钟，使溶剂干燥。用o2等离子体蚀刻聚苯乙烯/teflon表面一定时间。最后通过热蒸发在该表面涂上50nm的金，得到金锥。

本发明所述的一种基于tio2-b介观晶体的前列腺特异性抗原光电化学传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和ag/agcl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用au/ab1/psa/ab2/ag2s修饰电极，其由下述步骤的方法制备而成的，1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）au/ab1/psa/ab2/ag2s修饰电极的制备：滴加3μl金锥溶液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后将3μl巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰过的电极表面，在4°c下孵育50min，用二次水清洗，去除多余的溶液；将修饰电极于5μl浓度为1mg/ml的前列腺特异性抗原的抗体ab1溶液中4°c下孵育50min，随后使用ph7.4的磷酸缓冲溶液去除多余的前列腺特异性抗原的抗体ab1，再将电极浸入20μl浓度为1.0wt.%的bsa1h，封闭电极表面上非特异性活性位点，用ph7.4的磷酸缓冲溶液冲去表面残余液后，即得到au/ab1修饰电极；将电极浸入5μl不同前列腺癌细胞抗原（psa）标准溶液中于4°c下孵育50min；用ph7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到au/ab1/psa修饰电极；吸取5μl标记过的二抗ab2-tio2-b@cs-ag⁺滴涂到au/ab1/psa修饰电极表面，在4°c下孵育1h，用ph7.4的磷酸缓冲溶液洗去未反应的多余二抗，得到au/ab1/psa/ab2修饰电极；最后吸取5μl0.26m的h2o2与0.18m的s2o3^2-溶液一起滴涂到修饰的au/ab1/psa/ab2电极表面，反应15min，在h2o2与tio2-b@cs的催化作用下，原位生成ag2s，得到au/ab1/psa/ab2/ag2s电极。

本发明所述的一种基于tio2-b介观晶体的光电化学传感器用于前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，步骤如下：1）采用三电极体系进行测定，以au/ab1/psa/ab2/ag2s修饰电极为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为-0.1v，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；2）在ph7.4的pbs缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10^-6ng/ml–50ng/ml一系列不同溶度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。

本发明的显著优点为：

(1)金作为一种贵金属，有良好的导电性，以金锥作为基底材料，可以有效的促进光生电子的转移，增强光电响应，tio2-b@cs具有催化效果，在h2o2的存在下，tio2-b@cs催化s2o3^2-生成s^2-，s^2-与ag⁺反应生成ag2s，使光电流的增强。

(2)待测物质psa与相应的标记二抗发生免疫反应，随着待测物质浓度的增大，标记的二抗浓度也增大，光电信号也逐渐增强，通过这一现象实现对psa的灵敏检测。

附图说明

图1为本发明所述的基于tio2-b原位信号放大的夹心型生物传感器构建过程示意图。

图2a为不同浓度1×10^-6ng/ml–50ng/ml（a-i）前列腺特异性抗原标准溶液，传感电极的光电流响应图。

图2b为不同浓度标准溶液所对应的线性曲线。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

一种基于tio2介观晶体的光电化学传感器的制备方法(如图1所示)：

（1）玻碳电极的预处理：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；

（2）au/ab1/psa修饰电极的制备：滴加3μl浓度为2mg/ml的金锥(auncs)溶液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；然后将3μl浓度为5mm的巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰过的电极表面，在4°c下孵育50min，用二次水清洗，去除多余的溶液，将修饰电极于5μl浓度为1mg/ml的前列腺特异性抗原的抗体ab1溶液中4°c下孵育50min，随后使用ph7.4的磷酸缓冲溶液去除多余的前列腺特异性抗原的抗体ab1，再将电极浸入20μl浓度为1.0wt.%的牛血清白蛋白（bsa）溶液1h，封闭电极表面上非特异性活性位点，用ph7.4的磷酸缓冲溶液冲去表面残余液后，即得到au/ab1修饰电极，将电极浸入5μl不同浓度的前列腺癌细胞抗原（psa）标准溶液中于4°c下孵育50min，用ph7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到au/ab1/psa修饰电极；

（3）au/ab1/psa/ab2/ag2s修饰电极的制备：称取一定量的tio2-b固体粉末，用二次水分散均匀，配制成浓度为3mg/ml的悬浮液，将tio2-b溶液与0.5wt.%壳聚糖溶液按照体积比为1:2的比例进行混合，摇匀30min，反应好的溶液在转速为5000rpm的转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入一定量的二次水分散，形成tio2-b@cs溶液；按照agno3溶液与tio2-b@cs体积比为1:1的比例，将浓度为0.1mol/l的agno3溶液加入到tio2-b@cs溶液中，摇匀反应30min，使ag⁺充分吸附到tio2-b表面，通过离心，去除多余的ag⁺，再将固体用二次水分散均匀形成处理过的tio2-b溶液；按照体积比为1:3的比例将前列腺特异性抗原二抗(ab2)与处理过的tio2-b溶液混合，在4°c下反应2h，离心去除未吸附的二抗，用ph为7.4的磷酸缓冲溶液分散，再加入一定量的bsa溶液封闭非活性位点，得到ab2-tio2-b@cs-ag⁺溶液，放置冰箱待用；用移液枪吸取一定量的ab2-tio2-b@cs-ag⁺溶液，滴涂到au/ab1/psa修饰电极上，在4°c下孵育1h，用二次水清洗，除去多余的物理吸附，得到au/ab1/psa/ab2电极；在室温下，将0.26m的h2o2与0.2m的agno3溶液一起滴涂到修饰的au/ab1/psa/ab2电极表面，反应15min，在h2o2与tio2-b@cs的催化作用下，原位生成ag2s，得到au/ab1/psa/ab2/ag2s电极。

实施例2

实施例1所用的tio2-b材料的制备：

tio2-b纳米棒的制备用钛纳米线作为前驱体通过溶剂热法合成。1gtio2分散到75ml15m的koh水溶液中。摇匀10分钟后，得到的悬浮液转移到100ml的反应釜中，将反应釜放置于170°c下反应72h，然后冷却至室温。得到的沉积物用醋酸溶液清洗直到ph为7.0。最终产物通过离心收集，在60°c的鼓风烘箱中干燥12h制成tio2纳米线前驱体。tio2-b的合成，首先将300mg制得的tio2纳米线前驱体分散在50ml浓度为8m的醋酸溶液中，接着将溶液转移到反应釜中，加热到180°c，反应24h。得到的产物通过离心收集，用二次水和乙醇清洗，在60°c下干燥一夜。

实施例1所用的金锥(auncs)的制备：

在旋涂聚苯乙烯之前，首先将teflon膜切割成1.5cmx1.5cm正方形并用乙醇和二次水冲洗，然后用等离子水清洗3分钟。吸取1ml浓度为2.5w/v%的聚苯乙烯溶液并将其离心，再转移到乙醇和甲醇的体积比为2:1的混合溶液中。在溶液中加入体积比为0.2%的表面活性剂(tx100)，接着将聚苯乙烯的浓度调节至约5w/v%。然后将聚苯乙烯旋涂在清洁的teflon膜上，并在室温下放置几分钟，使溶剂干燥。用o2等离子体蚀刻聚苯乙烯/teflon表面一定时间。最后通过热蒸发在该表面涂上50nm的金，得到金锥。

实施例3

一种基于tio2-b晶体的光电化学传感器用于前列腺特异性抗原的检测方法，步骤如下：

（1）采用三电极体系进行测定，以实施例1制得的au/ab1/psa/ab2/ag2s修饰电极为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为-0.1v，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；

（2）在ph7.4的pbs缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10^-6ng/ml–50ng/ml一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线。图2a为不同浓度1×10^-6ng/ml–50ng/ml（a-i）前列腺特异性抗原标准溶液，传感电极的光电流响应。图2b为传感电极的光电流响应与前列腺特异性抗原标准溶液浓度的线性关系图。

将待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。