一种并行探测荧光发射差分显微成像的方法和装置与流程

本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种并行探测荧光发射差分显微成像的方法和装置。

背景技术：

这几个世纪以来，光学显微镜在科学中发挥了重要作用，为人们观测微观结构及其运动提供了一种可行的方法。然而，阿贝衍射极限将常规荧光显微镜的分辨能力限制在约为照明光波长的一半，限制了长度尺度小于100nm的微结构观察。为此，人们发明了各种超分辨显微技术，而共焦显微成像技术是其中应用最为广泛的一种。共焦成像系统高使用率高主要是由于该技术能够生成具有高对比度的光学切片图像，突破了普通光学显微镜衍射极限的限制，横向分辨率是相同数值孔径的普通光学显微镜的1.4倍，纵向分辨率可以达到亚微米量级，同时具有简单性，多功能性和无创性的特点，能够满足各种样品和应用需求。

在共焦显微成像的基础上，荧光差分显微成像技术先用一个实心光斑扫描样品激发荧光，收集荧光信号，再将实心光斑调制为空心光斑用于扫描样品激发荧光，第二次收集荧光信号，最后将两个荧光信号做差分处理，得到分辨率更高的样品图像。

然而荧光差分显微成像技术和共焦显微镜都是采用针孔来滤除焦平面以外的光信号，从而实现光切片效果，但是过小的针孔会导致收集的焦面信号太弱，从而减小信噪比；较大的针孔会影响其光学切片效果，从而限制了分辨率，因此人们必须通过权衡系统的信噪比和分辨率来确定合适的针孔尺寸。与之前马也(详见文献may,kuangc,fangy,etal.virtualfluorescenceemissiondifferencemicroscopybasedonphotonreassignment[j].opticsletters,2015,40(20):4627.)、葛宝梁(详见文献geb,wangy,huangy,etal.three-dimensionalresolutionandcontrast-enhancedconfocalmicroscopywitharraydetection[j].opticsletters,2016,41(9):2013.)和李屹成(详见文献liy,lius,liud,etal.imagescanningfluorescenceemissiondifferencemicroscopybasedonadetectorarray[j].journalofmicroscopy,2017.)提出的几种基于并行探测和差分显微技术的方法相比，本发明由于实心斑和空心斑照明成像都采用并行探测技术(马也采用空心斑照明加并行探测技术，葛宝梁和李屹成采用实心斑照明加并行探测技术)，因此具备更高的分辨率以及信噪比，从而最终能够获得质量更高的显微图像。

技术实现要素：

本发明的目的为提供一种并行探测荧光发射差分显微成像的方法，利用该方法可以同时具备小针孔的分辨率优势与大针孔的收集效率，可以在保持高分辨率的前提下提高图像的信噪比。

本发明的另一目的为提供一种实现上述方法的并行探测荧光发射差分显微成像装置，该装置可用于实现上述方法，使用一个光纤探测器阵列来代替荧光差分显微成像技术的针孔和单一探测器，然后用一个实心光斑扫描样品激发荧光，将探测器阵列中每个探测器收集到的该荧光信号进行图像处理，合成一张高分辨率且高信噪比的图像；再用空间光调制器将入射的实心光斑调制为空心光斑，投射到样品上激发荧光，再次用同样的方法将探测器阵列中每个探测器收集到的该荧光信号进行图像处理，合成第二张图像，最后将两个图像进行差分处理，从而获得更高分辨率的图像。

为了实现上述目的，本发明提供的并行探测的荧光发射差分显微成像的方法包括以下步骤：

1)激光器发出激光光束，将其准直后转换为线偏光；

2)对所述线偏振光进行相位调制，调制图案为0相位图，其调制函数为f1(r,θ)＝0，其中r为光束内某一点到光轴的距离，θ为该点垂直光轴的剖平面上位置极坐标矢量与极轴的夹角；

3)使用两个四分之一波片将所述相位调制后的线偏振光转换为圆偏振光；

4)所述圆偏振光在二维扫描振镜系统的调制下投射在待测样品上进行二维扫描；

5)使用探测器阵列收集所述待测样品在二维扫描过程中发出的荧光信号，并将外围探测器收集的信号移回中心，再将所有图像加起来后进行归一化处理获得并行探测荧光信号光强i1(x，y)，其中x，y为样品上扫描点的二维坐标；

6)将步骤2)中的调制图案切换为涡旋相位图，其调制函数为f1(r,θ)＝θ，其中r为光束内某一点到光轴的距离，θ为该点垂直光轴的剖平面上位置极坐标矢量与极轴的夹角；

7)重复步骤3)，步骤4)，使用探测器阵列再次收集所述待测样品在二维扫描过程中发出的荧光信号，并将外围探测器收集的信号移回中心，把所有图像加起来后进行归一化处理，再次获得并行探测荧光信号光强i2(x，y)，其中x，y为样品上扫描点的二维坐标；

8)最后，我们所需的并行探测差分信号光强i(x，y)可以由两次扫描获得的并行探测荧光信号光强计算得到，计算公式为i(x，y)＝i1(x，y)-βi2(x，y)，其中β为经验参数，一般是设为0.7；

其中，所述线偏光为p偏振光，因为空间光调制器只能调制p偏振光。

其中，将p偏光再次转换为圆偏光进行扫描是为了使投射到样品上的光斑更均匀。

其中，使用两个四分之一波片是为了使调制后的圆偏光的偏振度更好。

其中，根据需要的视场设置二维扫描振镜系统的扫描范围。

其中，步骤2)中调制后的激光束为高斯光束。

其中，步骤6)中调制后的激光束为空心光束。

其中，所述并行探测差分信号光强值i(x，y)为负时，令其等于零。

本发明的原理如下：

激光器发出激光光束，将其准直后转换为线偏光；对所述线偏振光进行相位调制，调制图案为0相位图，再将其转换为圆偏振光后投射在待测样品上进行二维扫描；使用探测器阵列收集所述待测样品发出的荧光信号，并将外围探测器收集到的信号移回中心，再将所有图像加起来后进行归一化处理获得并行探测荧光信号光强；将调制图案切换为涡旋相位图，再次对所述线偏振光进行相位调制，重复上述步骤再次获得并行探测荧光信号光强；最后，将两次扫描获得的并行探测荧光信号光强相减获得并行探测差分信号光强，从而得到更高分辨率的图像。

为实现上述另一目的，本发明还提供了一种并行探测荧光发射差分显微成像的装置，包括产生激发光束的照明系统和收集样品发出荧光信号的探测系统。

在照明光路的光轴上，依次设有：

用于产生激光光束的激光器；

用于将所述激光器发出的激光光束准直的准直物镜；

用于将所述准直后的激光光束转换为线偏光的起偏器；

用于将所述线偏光转换为p偏光的二分之一波片；

用于对所述p偏光进行相位调制的空间光调制器；

用于将所述p偏光转换为圆偏光的四分之一波片；

用于反射所述激光光束的二色镜；

用于改变所述圆偏光的方位角并偏转光路，从而对样品进行二维扫描的扫描振镜系统；

用于消除经过扫描振镜系统后的所述圆偏光的畸变的扫描透镜；

用于将所述经过扫描透镜的圆偏光准直和扩束，并使振镜和物镜入瞳面共轭的场镜；

用于将所述经过场镜准直后的圆偏光聚焦从而扫描样品的物镜；

用于放置待测样品的样品台。

在探测光路的光轴上，依次设有：

用于放置待测样品的样品台；

用于收集样品台上样品发出的荧光信号的物镜；

用于将所述经过物镜的荧光聚焦的场镜；

用于将所述经过场镜的荧光准直和缩束，并使振镜和物镜入瞳面共轭的扫描透镜；

用于改变所述荧光的方位角并偏转光路，从而解扫描的扫描振镜系统；

用于透射所述荧光信号的二色镜；

用于滤除二色镜透射的杂散光的滤光片；

用于将经过滤光片的所述荧光光束聚焦到多模光纤阵列上的聚焦透镜；

用于采集所述荧光信号的探测器阵列。

还设有用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器以及用于处理所述荧光信号的计算机；

所述照明光路和探测光路上设置的样品台、物镜、场镜、扫描透镜、扫描振镜系统和二色镜均指同一器件。

所述空间光调制器的入射光和出射光的夹角应尽可能小，以减小由于光穿过不止一个像素区域引起的串扰效应以及使相位行程接近设计值。

作为优选的，所述空间光调制器的入射光和出射光的夹角为5度。

所述空间光调制器可切换0相位图案和涡旋相位图，其调制函数分别为f1(r,θ)＝0和f1(r,θ)＝θ，其中r为光束内某一点到光轴的距离，θ为该点垂直光轴的剖平面上位置极坐标矢量与极轴的夹角；

所述多模光纤起空间滤波器的作用，即针孔；

所述多模光纤阵列中的每根多模光纤与探测器阵列中的一个探测器相连；

优选的，所述的多模光纤阵列包括呈中心多模光纤，以及环列在所述中心多模光纤外的至少两层排列呈环形的多模光纤。本发明中，所述的多模光纤阵列排列方式如附图2所示，共有3层19根多模光纤；包括一根中心多模光纤，绕所述中心多模光纤呈环形排布的二层多模光纤和三层多模光纤，其中二层多模光纤的数量为6根，三层多模光纤为12根。

所述探测器阵列由雪崩光电二极管(apd)组成；

作为优选的，所述物镜的数值孔径(na)为1.4；

作为优选的，多模光纤阵列的有效直径约为一个爱里斑大小；

作为优选的，多模光纤阵列中单根光纤的内径约为0.2个爱里斑大小。

本发明对比已有技术具有以下优点：

(1)同时具备小针孔的分辨率优势与大针孔的收集效率，可以在保持高分辨率的前提下提高图像的信噪比；

(2)能够十分简单地由传统的共聚焦显微系统改进而成，并且操作简单方便；

(3)能够以较低的光功率获取更高分辨率的超分辨图像。

附图说明

图1为本发明并行探测荧光发射差分显微成像的装置示意图；

图2为本发明中多模光纤阵列装置示意图；

图3为本发明中的实心激光束的psf；

图4为本发明中的空心激光束的psf；

图5为本发明中并行探测差分荧光信号光强与共焦信号光强的psf归一化比较曲线。

图6为本发明中并行探测差分荧光信号光强与其它几种并行探测差分显微信号光强的psf比较曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

一种基于并行探测的荧光发射差分显微成像的装置，如图1所示，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4，二分之一波片5，第一反射镜6，空间光调制器7，第二反射镜8，第三反射镜9，第一四分之一波片10，第二四分之一波片11，二色镜12，二维扫描振镜系统13，扫描透镜14，场镜15，第四反射镜16，物镜17，样品台18，滤波片19，聚焦透镜20，光纤阵列21，探测器阵列22，计算机23。

本发明的装置实施例主要分为三部分：产生激发光束的照明系统、收集样品发出荧光信号的探测系统以及处理器，本实施例的处理器为计算机23。

其中，激光器1，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4，二分之一波片5，第一反射镜6，空间光调制器7，第二反射镜8，第三反射镜9，第一四分之一波片10，第二四分之一波片11，二色镜12，二维扫描振镜系统13，扫描透镜14，场镜15，第四反射镜16，物镜17，样品台18依次设置在照明系统的光轴上；

其中，样品台18，物镜17，第四反射镜16，场镜15，扫描透镜14，二维扫描振镜系统13，二色镜12，滤波片19，聚焦透镜20，光纤阵列21，探测器阵列22依次设置在探测系统的光轴上；

其中，计算机23用于控制空间光调制器7的调制图案切换，二维扫描振镜系统13的扫描以及探测器阵列22的信号采集；

采用图1所示的装置，使用并行探测荧光发射差分显微的方法如下：

1)激光器1发出激光光束(本实施例采用波长为635nm的红光作为激发光)被耦合进单模光纤2，再从单模光纤2出射后被准直透镜3准直，准直后的光束通过起偏器4成为线偏振光，线偏振光通过二分之一波片5被调制为p偏振光，然后被第一反射镜6反射到空间光调制器7上。

2)空间光调制器7对入射的p偏振光进行相位调制，调制图案为0相位图，其调制函数为f1(r,θ)＝0，其中r为光束内某一点到光轴的距离，θ为该点垂直光轴的剖平面上位置极坐标矢量与极轴的夹角。

3)第二反射镜8和第三反射镜9将调制后的p偏振光反射到第一四分之一波片10，第一四分之一波片10和第二四分之一波片11将所述相位调制后的p偏振光转换为圆偏振光，再被二色镜12反射到二维扫描振镜系统13。

4)二维扫描振镜系统13改变入射的圆偏光的方位角并偏转光路，二维扫描振镜系统出射的圆偏光经过扫描透镜14后消除畸变，再经过场镜15的准直和扩束，被第四反射镜16反射到物镜17上，最后通过物镜17被聚焦到样品台18上的待测样品上激发出荧光信号。

5)样品台18上的待测样品发射的荧光信号被物镜17收集，之后被第四反射镜16反射到场镜上，再经过场镜15的聚焦和扫描透镜14的准直到达扫描振镜系统13，解扫描后被二色镜12透射至滤波片19，滤除杂散光后被聚焦透镜20聚焦在多模光纤阵列21上。多模光纤阵列排列方式如图2所示，其中每个小圆代表一根多模光纤，并与一个探测器相连，其直径约为0.2个爱里斑，整个多模光纤阵列的直径约为1个爱里斑。使用探测器阵列22收集荧光，并用计算机23将外围探测器收集的信号移回中心，再将所有图像加起来后进行归一化处理获得并行探测荧光信号光强i1(x，y)，其中x，y为样品上扫描点的二维坐标。该并行探测荧光信号光强i1(x，y)的psf如图3所示。

6)将步骤2)中的调制图案切换为涡旋相位图，其调制函数为f1(r,θ)＝θ，其中r为光束内某一点到光轴的距离，θ为该点垂直光轴的剖平面上位置极坐标矢量与极轴的夹角。

7)重复步骤3)，步骤4)和步骤5)，再次获得并行探测荧光信号光强i2(x，y)，其中x，y为样品上扫描点的二维坐标。该并行探测荧光信号光强i2(x，y)的psf如图4所示。

8)最后，我们所需的并行探测差分信号光强i(x，y)可以由两次扫描获得的并行探测荧光信号光强计算得到，计算公式为i(x，y)＝i1(x，y)-βi2(x，y)，其中β为经验参数，一般是设为0.7。

本发明与之前方法的psf分布曲线比较如图5所示。其中，“共焦”为常规共聚焦显微方法的psf；“并行探测共焦”为采用了并行探测的共聚焦显微方法的psf，即本发明所述并行探测荧光信号光强i1(x，y)的psf；“差分”为常规荧光发射差分显微方法的psf；“并行探测差分”为本发明所述并行探测差分信号光强i(x，y)的psf。由图5可以看出，本发明中的并行探测差分信号光强i(x，y)的psf尺寸较另外三种方法的psf尺寸都有明显减小，因此本发明可以进一步提高分辨率。

本发明与之前几种并行探测差分方法的psf分布曲线比较如图6所示。其中，“并行探测差分马”为马也提出的并行探测差分技术的psf、“并行探测差分葛”为葛宝梁提出的并行探测差分技术的psf和“并行探测差分李”为李屹成提出的并行探测差分技术的psf，“并行探测差分”为所述并行探测差分信号光强i(x，y)的psf。由图6可以看出，本发明中的并行探测差分信号光强i(x，y)的psf尺寸较另外三种并行探测差分方法的psf尺寸要小，也就是具有更高的分辨率。其中，虽然马也提出的并行探测差分技术的psf与本发明较为接近，但是由于其差分中被减的一项是由单个小针孔探测所成的像，因此会影响最后结果的信噪比。而本发明由于实心斑和空心斑照明成像都采用并行探测技术，因此差分中的两项都具有较高的信噪比，最终结果能够兼具高分辨率和高信噪比的优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。