一种定量检测鸡消化道内阿维拉霉素的方法与流程

本发明涉及动物消化道内物质检测技术领域，具体涉及一种定量检测鸡消化道内阿维拉霉素的方法。

背景技术：

阿维拉霉素是一种促生长类抗生素，主要作用于革兰氏阳性菌，常作为饲料添加剂应用于临床以促进动物生长，预防治疗疾病。阿维拉霉素的促生长机制主要是通过节约消化道内葡萄糖的消耗，提高挥发性脂肪酸的生成，以降低消化道内代谢产物。此外还可增加动物体内氮的沉积使得饲料中蛋白质的利用率和部分氨基酸消化率增加，以此达到促进生长的作用。阿维拉霉素的抗菌作用机制主要是干扰细菌蛋白质的合成，研究表明，阿维拉霉素可降低消化道内大肠杆菌的粘附型，通过抑制细菌鞭毛的生长和细菌的粘附，以达到抑菌作用。相关文献研究表明阿维拉霉素能有效的控制和治疗产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎。因此阿维拉霉素可作为抗菌药用于预防和治疗产气荚膜梭菌引起家禽的坏死性肠炎，具有良好的发展前景。

动物源性细菌耐药性已是全球关注的重要问题，为加强兽用抗菌药的治疗水平、减少细菌耐药性，保障畜禽的健康安全和畜牧业的良好发展，建立和完善兽用抗菌药的给药方案至关重要。建立的给药方案要使得鸡体内药物的分布浓度高于耐药选择突变窗内，因此本发明建立了一种鸡消化道内阿维拉霉素的定量检测方法，判断阿维拉霉素在鸡消化道内的含量是否具有最佳效果。

前期关于阿维拉霉素的检测方法主要是液相色谱-质谱串联技术和高效液相色谱法-蒸发光散射检测器(elsd)串联使用，其操作方案的费用较为昂贵，操作复杂，而且目前关于阿维拉霉素的提取方法局限在猪和大鼠的肌肉、脂肪，鲤鱼的血浆和组织，而针对鸡消化道中的阿维拉霉素检测还没有一种简单有效的方法。

技术实现要素：

本发明为克服现有技术的不足，提供一种鸡消化道内阿维拉霉素的hplc检测方法，能够有效减少消化道内杂质的干扰，使用合理的提取方法和定量方法实现准确定量，建立一种操作简单、快速、灵敏度高、准确可靠的阿维拉霉素检测方法，可准确检测出鸡消化道中阿维拉霉素的含量。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种定量检测鸡消化道内阿维拉霉素的方法，包括如下步骤：

(1)准备阿维拉霉素标准品溶液和待检测的样品提取液；

(2)绘制标准曲线：将3-5份不同浓度的标准品溶液分别用于hplc测定洗脱方式是梯度洗脱，记录标准品色谱图和峰面积，进行线性回归分析；

(3)准确度和精密度：准确度和精密度分别用回收率和变异系数来表示；空白鸡消化道内容物加入高、中、低三个浓度的阿维拉霉素，按照待检测的样品提取液的提取方法制备样品净化液供hplc检测；同一天内每个浓度重复5次，取平均值，计算日内相对误差即为日内变异系数；每个浓度重复5天；计算平均值和相对误差，得到日间变异系数；回收率采用单点校准法计算，公式如下：

x＝av/asw×100％(a)

式中：x-试样中待测物回收率；a-试样的峰面积；v-试样提取吹干后定容体积，单位ml；as-标准工作液的峰面积；

w：试样体积，单位ml；

(4)绘制工作曲线：取空白鸡消化道内容物，在其中加入3-5份不同浓度的阿维拉霉素，按照样品提取液相同的提取方法进行提取，hplc检测；重复三次后将所得峰面积与对应浓度作线性回归，绘制工作曲线并计算出阿维拉霉素在鸡消化道内容物中的回归方程和相关系数；

(5)实际样品测定和结果计算：鸡单次灌胃阿维拉霉素后，采集其消化道内容物进行提取和hplc检测，记录色谱图和峰面积，并以步骤(4)所得的线性回归方程分别计算出单次给药后不同时间点鸡消化道内阿维拉霉素的含量。

作为本发明的进一步改进，hplc检测条件如下：

色谱柱：agilentsb-aq，250×4.6mm(i.d.)，5μm；

流动相：乙腈(b)-100mm乙酸铵(a)；

紫外检测波长：295nm；

进样量：35μl；

流速：0.5ml/min；

柱温：30℃；

流动相洗脱方案如下：

进一步地，所述阿维拉霉素标准品溶液的溶剂为甲醇，浓度为0.1～20μg/ml。

进一步地，所述流动相中乙腈的浓度为100％，乙酸铵的浓度为0.1mol/l。

作为本发明的进一步改进，待检测的样品提取液的制备方法如下：

(1)向待检测的回肠内容物中加丙酮作为提取液，涡旋，离心，取上清液，向其中依次加入nacl稀溶液和饱和的正己烷进行除脂；以二氯甲烷作为萃取剂，涡旋，离心，除去上层的正己烷层，保留下层的二氯甲烷层，并于氮气气氛下吹干；固相残渣用三氯甲烷复溶，待净化；

(2)固相萃取净化：选用硅胶萃取柱，先用甲醇，三氯甲烷活化，用三氯甲烷和丙酮的混合液进行淋洗和洗脱，收集洗脱液，并于氮气气氛下吹干，用初始流动相(即100mm乙酸铵:乙腈＝57:43)溶解残渣，得到待检测的样品提取液。

优选的，所述nacl稀溶液的浓度为10wt％。

优选的，所述氮气气氛为50℃氮气气氛。

优选的，所述淋洗液为体积比为4:1的三氯甲烷和丙酮混合液，洗脱液为体积比3:7的三氯甲烷和丙酮混合液。

与现有技术相比，本发明产生的技术效果如下：

本发明的方法准确度高，精确度和灵敏度好，杂质较少，作为鸡消化道内阿维拉霉素的含量检测方法，对阿维拉霉素在鸡体内的代谢分布检测提供了很好的指导意义；本发明针对常规的hplc法进行了改进，将流速由1ml/min变成0.5ml/min，流速减慢使目标药物吸收峰的保留时间增长，延迟了出峰时间，增加了各峰之间的分离度，使得目标药物峰的灵敏度增高，对淋洗液和洗脱液进行重新调整，与常规洗脱液相比，回收率提高。本发明中的洗脱液中，加入三氯甲烷，在硅胶萃取柱中与药物的结合力增强，提高了回收率。鸡消化道中阿维拉霉素的提取剂选用丙酮，除脂后选用二氯甲烷进行二次提取，最后用silica硅胶萃取柱进行萃取，使样品中杂质减少，检测的精确度和灵敏度高，回收率达到检测要求。

附图说明

图1为阿维拉霉素标准品的标准曲线图和方程式；

图2为鸡消化道内容物样品处理后阿维拉霉素的工作曲线图和回归方程；

图3为实施例1中空白样品溶液色谱图；

图4为实施例1中样品溶液色谱图(浓度为0.4μg/ml)；

图5为对比例1的标准品色谱图；

图6为对比例1的空白样品色谱图；

图7为对比例2的空白样品色谱图；

图8为对比例2中样品溶液色谱图(浓度为0.4μg/ml)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

液相色谱仪：岛津lc-20ad；

检测器：岛津spd-20a紫外可见光检测器；

色谱柱：agilentsb-aq，250×4.6mm(i.d.)，5μm；

流动相a：0.1mol/l乙酸铵；

流动相b：100％乙腈；

紫外检测波长：295nm；

进样量：35μl；

流速：0.5ml/min；

柱温：30℃。

流动相洗脱方案见下表

具体的检测方法如下：

(1)制备阿维拉霉素标准品储备液：精密称取阿维拉霉素标准品12.5mg，溶于10ml甲醇中，超声加热溶解，作为阿维拉霉素标准品储备液一，取储备液一，分别用甲醇稀释50倍、100倍，作为储备液二和三；

(2)制备阿维拉霉素标准品工作液：将储备液三分别稀释2倍、10倍、20倍、50倍、100倍制成5份不同浓度的工作液待hplc检测；

(3)绘制标准曲线：打开液相色谱仪和检测器，待仪器参数达到要求后，平衡基线20min，将上述5份工作液依次进样，每个溶液平行3次，记录色谱图，如图3，以峰面积与对应浓度进行线性回归分析，得到标准曲线和方程式，如图1所示；

(4)鸡消化道内阿维拉霉素的提取：准确称取1g鸡肠内容物于10ml离心管管中，加丙酮3ml，涡旋5min，10000r/min离心10min.取上清液于100ml离心管中，残渣中加入丙酮3ml，再按照上述方法提取一次，合并两次上清液。加入6ml10wt％nacl，涡旋5min，5000r/min离心4min，然后加入3ml10wt％饱和的正己烷，涡旋5min，5000r/min离心4min，去正己烷层(上层)，从而达到除脂的目的，再分别两次加入15ml，10ml二氯甲烷，涡旋5min，5000r/min离心4min，静置分层后取二氯甲烷层(下层)于50ml离心管中，合并两次二氯甲烷层于50℃氮气吹干，残渣用3ml三氯甲烷复溶，待净化；

spe净化：硅胶萃取柱(silica)用5ml甲醇，5ml三氯甲烷活化，取待净化液过柱，用5ml三氯甲烷：丙酮(4:1)混合液淋洗，5ml三氯甲烷：丙酮(3:7)洗脱，收集洗脱液，50℃氮吹，用1ml初始流动相溶解残渣，涡旋混匀，0.22μm滤膜，得到待检测的样品提取液；

(5)工作曲线：在空白的鸡消化道样品中加入相对应的阿维拉霉素标准品溶液，使得样品中的药物浓度达到0.2μg/ml、0.5μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml按照上述(4)的方法步骤处理得到样品提取液，然后打开液相色谱仪和检测器，待仪器参数达到要求后，平衡基线20min，将这5份样品依次进样，每个溶液平行3次，以峰面积与对应浓度进行线性回归分析，得到工作曲线和回归方程，如图2所示；

(6)准确度和精密度：准确度和精密度分别用回收率和变异系数来表示；在空白鸡消化道内容物加入0.2μg/ml、0.4μg/ml、2μg/ml三个浓度的阿维拉霉素，按照待检测的样品提取液的提取方法制备样品净化液供hplc检测；同一天内每个浓度重复5次，取平均值，计算日内相对误差即为日内变异系数；每个浓度重复5天；计算平均值和相对误差，得到日间变异系数；回收率采用单点校准法计算，公式为：x＝av/asw×100％，式中：x-试样中待测物回收率；a-试样的峰面积；v-试样提取吹干后定容体积，单位ml；as-标准工作液的峰面积；w：试样体积，单位ml；计算得到回肠内容物中阿维拉霉素的回收率为78.4％～90％，日间变异系数为2.8％～7.8％。

(7)样品检测和结果计算：鸡单次灌胃2.5mg/kg.b.w.阿维拉霉素后，采集其消化道内容物进行提取和hplc检测，记录如图4所示的色谱图和峰面积，根据实际检测样品的峰面积，带入步骤(5)的回归方程y＝14737x+1410.6(其中y表示峰面积，x表示药物浓度)，计算出对应的药物浓度，由此得到给药后不同时间点采集的鸡消化道内阿维拉霉素的含量,具体结果见附表1；

通过图3-4可以看出，得到阿维拉霉素的出峰时间在18.879min，保留时间较滞后，可以避开其他杂质峰的干扰。

表1实施例1的样品检测和计算结果

对比例1：

本对比例与实施例1的区别在于，hplc检测时流速为1ml/min。其余测量方法和待检测样品完全相同，hplc检测结果显示，目标峰保留时间在15min左右，但是消化道样品在15min处有明显的杂质峰，结果见附图5，图6。

对比例2：

本对比例与实施例1的区别在于，洗脱液为常规的洗脱液，即丙酮。其余测量方法和待检测样品完全相同。根据图7和图8的色谱图可以看出，丙酮作为提取液，其在目标峰保留时间点处与杂质峰没有分离。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。