一种DNA链作为信号开关检测重金属离子的制备方法与流程

本发明涉及一种dna链作为信号开关检测重金属离子的制备方法，属于重金属检测领域。具体地说是以在玻片上还原银纳米颗粒(agnps@si)为基底，通过dna单链作为拉曼检测的信号开关对重金属离子汞（hg²⁺）进行检测的方法。

背景技术：

重金属离子大部分是在工业生产过程中产生，如果没有经过处理就排放到自然界中会造成重金属污染。矿冶、机械制造、化工、电子、仪表等工业中许多生产过程中产生的含重金属离子的废水对水环境造成严重的污染。含有重金属离子的水被人类饮用，会造成人类患各种疾病，有的甚至会致癌。汞极少以纯金属状态存在，多以化合物形式存在，纯汞是无毒的，但它的化合物和盐的毒性非常高，严重的是它在生物体内会形成有机化合物。口服、吸入或接触后可以导致脑和肝的损伤。汞是一种可以在生物体内积累的毒物，它很容易被皮肤以及呼吸和消化道吸收，水俣病是汞中毒的一种。汞破坏中枢神经组织，对口、粘膜和牙齿有不利影响。长时间暴露在高汞环境中可以导致脑损伤和死亡。金属汞慢性中毒的临床表现，主要是神经性症状，有头痛、头晕、运动失调等。

对于重金属离子的准确性、特异性检测显得尤为重要。表面增强拉曼光谱技术（sers）具有对检测样品的需要量少，对样品无破坏性，而且灵敏度高的优点。本发明采用的在玻片上还原银纳米颗粒(ag-film)为基底，提高了对于重金属离子检测的重复性，加之用dna链连接在基底上的方法，对重金属离子的特异性检测起到关键作用。此技术使得对重金属离子检测的结果更精确和可靠。

技术实现要素：

为了克服现有重金属离子检测存在的费用高、预处理复杂、耗时长以及测量浓度要求高等问题，本发明的目的是提供一种dna链作为信号开关检测重金属离子的制备方法，具有易于操作，灵敏度高，特异性强，能节省大量时间与经济成本的优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述的一种dna链作为信号开关检测重金属离子的制备方法，包括如下步骤：

（1）表面增强拉曼散射（sers）基底ag-film的制备

1）清洗玻片：将玻璃片除油并用铬酸浸泡一整夜，超纯水洗净，在无水乙醇中超声30min，超纯水洗净，待用。

2）将处理后的玻璃片放入银铵溶液中，准确把控发生银镜反应的时间和温度，银镜反应的时间5min～20min，温度为70～90℃，从而在玻片镀上一层薄薄的银。

（2）构建检测重金属离子汞（hg²⁺）的探针

1）准备好的ag-film通过与单链cy5-b1-sh共轭来构建特异性感应hg²⁺的sers传感器。单链cy5-b1-sh为：cy5-ttctttcttccccttgtttgtt-sh。

2）cy5-b1-sh通过硫醇分子与基底ag-film相连，如若没有重金属离子hg²⁺，dna探针体现一个开放的构象(信号关闭)，cy5标记酶链的一端与基底相距较远，只能产生微弱的拉曼信号；在重金属离子hg²⁺存在时，开放的结构构象发生变化：开放的dna结构构象转变成由胸腺嘧啶(t)-hg²⁺-（t）形成的发夹结构，这种构象变化导致cy5标记分子和纳米颗粒表面的距离更近，从而产生强烈的拉曼信号(信号打开)。

在步骤（1）中的2）合成的表面增强拉曼散射（sers）基底，由于银镜反应在玻片上还原制备出的银纳米（ag-film）作为基底，方法简便，并使得sers增强因子(ef)大大地增强，提高了检测的灵敏度。

在步骤（2）中的2）cy5-b1-sh通过硫醇分子与基底（ag-film）相连，增强了dna链与银纳米颗粒连接的准确性，在增强信号的同时提高了重复性。

在步骤（2）中的2）通过硫醇分子与染料分子cy5标记的dna链在遇到重金属离子汞（hg²⁺）时够对其进行特异性检测，且检测的浓度要求低。

本发明采用更具体的技术方案为：

（1）表面增强拉曼散射（sers）基底（ag-film）的制备

1）玻片的切割和清洗：将切割好的玻璃片(0.5cm*0.5cm)首先除油并用铬酸浸泡一整夜，再用超纯水洗净，接着在无水乙醇中超声30min，超纯水清洗5-6次，待用。

2）于5ml的离心管中加入3ml0.1mol/l硝酸银溶液逐滴加入0.25mol/l氨水直至沉淀溶解，配制成银铵溶液，再加入6wt%的葡萄糖溶液0.05ml并摇匀。

3）将处理后的玻璃片放入银铵溶液中，准确把控发生银镜反应的时间和温度，银镜反应的时间5min～20min，温度为70～90℃。从而在玻片上镀上一层薄薄的银。取出玻片，在缓慢的氮气流中干燥，待用。

（2）构建检测重金属离子（汞（hg²⁺））的探针

1）准备好的ag-film通过与dna单链(cy5-b1-sh)共轭来构建特异性感应hg²⁺的sers传感器。将准备的基底(0.5厘米×0.5厘米)沉浸在组装缓冲区一整夜（组装缓冲区成分：包含1μmdna单链探针(cy5-b1-sh)—双重标记：染料分子cy5和硫醇分子-sh，和10mm磷酸溶液，其ph值为7.0）。接着将基底放入含有0.1m氯化钠的磷酸盐缓冲溶液（ph=7.0）中，放置12h，以保证足够的茎环结构的dna通过ag−s键与金属纳米颗粒进行自组装。再用ph值为7.0，浓度为100mm磷酸盐缓冲溶液(pbs)来清洗基底四次，然后进一步用温柔的氮气流干燥。

2）cy5-b1-sh通过硫醇分子与基底（ag-film）相连，如若没有重金属离子hg²⁺，dna探针体现一个开放的构象(信号关闭)，cy5标记酶链的一端与基底相距较远，只能产生微弱的拉曼信号。在重金属离子hg²⁺存在时，开放的结构构象发生变化：开放的dna结构构象转变成由胸腺嘧啶(t)-hg²⁺-（t）形成的发夹结构，这种构象变化导致cy5标记分子和纳米颗粒表面的距离更近，从而产生强烈的拉曼信号(信号打开)。将基底浸在含有不同浓度hg²⁺的溶液中，浸泡时间为120分钟。干燥后，进行sers检测，得到相应的谱峰。

本发明的优点在于：

1）本发明的方法具有预处理简单、样品需求量少、高特异性、高灵敏度且高重复性等优点，检测限达到～fm。

2）将银纳米粒子（agnps）修饰在玻片的表面，形成ag-film。银纳米粒子与硅之间的相互作用，起到增强拉曼信号的作用，本发明采用玻片作为还原银纳米颗粒的基板是极好的选择。

3）利用银镜反应在玻片上还原银纳米颗粒作为本发明的基底，方法步骤是极为简便、快速的，所用材料是普遍易得的且成本是较低的，重要的是无论在拉曼信号增强方面，还是检测结果的重复性方面也都有较好的提高。

4）本发明通过cy5标记的dna单链（cy5-b1-sh）在遇到重金属离子汞（hg²⁺）时通过与重金属离子发生相应的特殊结构变化，能够对其进行特异性检测，且对检测浓度要求低。

附图说明

图1为实施例1中合成的纳米结构基底（ag-film）的扫描电镜图。

图2为实施例1中基底（ag-film）的背景峰及以r6g溶液为检测对象所得的sers信号图。黑色线表示：玻片上的银纳米颗粒的sers信号，灰色线表示：将浓度为（10^-5g/ml）r6g滴在此基底上所得的sers信号。

图3为实施例1中以ag-film为基底测得的浓度从10^-6-10^-14汞离子（hg²⁺）标准溶液的表面增强拉曼光谱图，在浓度从10^-6-10^-14的hg²⁺标准溶液中的cy5信号，以及与背景信号的对比。

图4以拉曼标记cy5中sers峰值为1362cm^-1的标准工作曲线图。

具体实施方式

以下将结合实施例与附图对本发明做进一步说明。

实施例1

（1）表面增强拉曼散射（sers）基底（ag-film）的制备

1）玻片的切割和清洗：将切割好的玻璃片(0.5cm*0.5cm)首先除油并用铬酸浸泡3h，再用超纯水洗净，接着在无水乙醇中超声30min，超纯水清洗6次，待用。

2)于5ml的离心管中加入3ml0.1mol/l硝酸银溶液，再逐滴加入0.25mol/l氨水直至沉淀溶解，配制成银铵溶液，再加入6wt%的葡萄糖溶液0.05ml并摇匀。

3）将处理后的玻璃片放入银铵溶液中，准确把控发生银镜反应的时间和温度，银镜反应的时间15min，温度为75℃。从而在玻片上镀上一层薄薄的银。取出玻片，在缓慢的氮气流中干燥，待用。

（2）银膜基底（ag-film）的表征

将合成的银膜基底（ag-film）进行拉曼检测，得到基底的背景信号，如图2黑线所示无明显的拉曼峰，表明银膜基底不会对检测样品的sers信号产生影响。另外将浓度为（10^-5g/ml）的罗丹明6g（r6g）滴在此基底上检测获得r6g的sers信号（灰线），检测到完好的r6g的拉曼光谱峰型和增强效果。

（3）构建检测重金属离子（汞（hg²⁺））的探针

1）准备好的基底通过与单链cy5-b1-sh（其b1链：ttctttcttccccttgtttgtt）共轭来构建特异性感应hg²⁺的sers传感器。将准备的基底(0.5厘米×0.5厘米)沉浸在组装缓冲区一整夜（组装缓冲区成分：包含1μmdna探针(cy5-b1-sh)—双重标记：染料分子cy5和硫醇分子-sh，和10mm磷酸溶液，其ph值为7.0）。接着将基底放入含有0.1m氯化钠的磷酸盐缓冲溶液中，放置12h，以保证足够的茎环结构的dna通过ag−s键与金属纳米颗粒进行自组装。再用ph值为7.0，浓度为100mm磷酸盐缓冲溶液(pbs)来清洗基底四次，然后进一步用温柔的氮气流干燥。

2）cy5-b1-sh通过硫醇分子与基底（ag-film）相连，如若没有重金属离子hg²⁺，dna探针体现一个开放的构象，信号关闭；在重金属离子hg²⁺存在时，开放的结构构象发生变化，形成的发夹结构，这种构象变化导致cy5标记分子和纳米颗粒表面的距离更近,从而产生强烈的拉曼信号(信号打开)。将基底浸在含有不同浓度hg²⁺的溶液中，浸泡时间为120分钟。干燥后，进行sers检测，得到相应的谱峰。

3）hg²⁺标准溶液的检测

hg²⁺标准溶液的配制：简短地来说，用超纯水来稀释初始浓度为10^-3m的汞离子溶液来配制一系列hg²⁺溶液，然后将溶液完全摇匀，形成高度分散的溶液。最终获得浓度从10^-6到10^-15m的hg²⁺标准溶液。

把组装好的底物浸泡于不同浓度的hg²⁺标准溶液中120min，然后洗涤3次。干燥后，使用功率为5mw的785nm激光进行sers测量，并用20倍物镜观察和检测基板，得到相应的拉曼光谱，如图3所示。随着hg²⁺浓度从10fm增加1µm，cy5光谱中1595cm^-1峰位处的sers强度由2153.6逐渐增加到14478.8(a.u.)（图4），所得的标准曲线y=1575.7x+24019，计算所得相关系数r²=0.9991，表明hg²⁺浓度与探针的sers峰强呈现一个良好的线性关系。（4）检测人体血液中的汞离子（hg²⁺）

人血浆样品的制备：受试者禁食12h，在明日7点至8点之间进行抽血3ml，加入凝血剂，采用每分钟2000rpm离心15min，取上层清液即血清样品。

为了评价该方法的实用性，则将此传感器用于检测真实人体血液样本的hg²⁺离子。我们采用的方法是标准加入法，我们测量了健康人血液中hg²⁺离子的含量，并向血样中分别滴入不同浓度的hg²⁺标准溶液，每个样品的sers测量重复三次。相关统计数据如表1所示，结果表示对hg²⁺离子的回收率为91-104%，展现出一个良好的回收率。

表1人血液样品中hg²⁺离子的测定结果

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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<110>福建师范大学

<120>一种dna链作为信号开关检测重金属离子的制备方法

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