一种大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂及检测方法与流程

本公开涉及一种大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂及检测方法。

背景技术：

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

大豆异黄酮大多以豆粕为原料进行提取制备，对于提取获得的大豆异黄酮的检测方法紫外分光光度计检测法、高效液相色谱(hplc)法、薄层层析扫描检测法。紫外分光光度计检测法是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的检测方法。高效液相色谱法是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。其中，对于大豆异黄酮的检测主要为紫外分光光度计检测法和高效液相色谱法，其主要原因是这两种方法相对于薄层层析扫描检测法来说，不需要展开剂或对流动相的要求较高。而薄层层析扫描检测法要求在展开剂在特定的展距下能够将化合物进行分离，需要对展开剂进行大量的预实验，甚至找不到合适的展开剂进行分离，从而增加薄层层析扫描检测法检测大豆异黄酮的难度。然而据本公开发明人的研究发现，对于大豆异黄酮说，由于其相近、相同的吸收波长范围，紫外分光光度计难以实现准确检测；而高效液相色谱法需要良好的样品前处理，否则会堵塞hplc分离柱，从而也会导致高效液相色谱法的检测不准确。

技术实现要素：

薄层层析扫描方法可有效解决分光光度计法及hplc法检测所面临缺陷，为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂及检测方法，该展开剂能够对大豆异黄酮苷中黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷在13cm的展距中完全展开，从而实现薄层层析扫描检测。

为了实现上述目的，本公开的技术方案为：

一方面，一种大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂，由二氯甲烷、甲醇、乙酸组成，二氯甲烷、甲醇、乙酸的体积比为10～11:1～2:0.1～0.2。

本公开通过实验表明，本公开的展开剂能够将黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷在13cm的展距中完全展开。

另一方面，一种大豆异黄酮苷的薄层层析检测方法，提供上述大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂，将待测样品点于薄层硅胶板，将点有待测样品的薄层硅胶板放置在含有上述大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂的展缸中，进行上行展开，利用薄层扫描仪对展开后的薄层硅胶板进行扫描检测。

本公开的检测方法能够对大豆异黄酮苷中的黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷进行准确定量分析。

本公开的有益效果为：

1.本公开提供的薄层层析展开剂能够将大豆异黄酮苷中黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷完全分离，且分离的距离在13cm以内，从而实现薄层层析法对大豆异黄酮苷中黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷进行定量分析。

2.本公开提供的薄层层析检测方法，由于采用的展开剂能够在13cm的展距中将黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷完全分离，因而该方法定量分析的准确性更高。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为本公开实施例1的黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、样品3d扫描图，a为样品中展开距与大豆苷对应峰，b为样品中与黄豆黄苷、染料木苷对应峰；

图2为本公开实施例1的黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、样品全波长3d扫描图；

图3为本公开实施例1的黄豆黄素、大豆苷元、染料木素、样品3d扫描图，a为样品中展开距与大豆苷元对应峰，b为样品中与黄豆黄素、染料木素对应峰；

图4为本公开实施例1的黄豆黄素、大豆苷元、染料木素、样品全波长3d扫描图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于分光光度计法及hplc法检难以检测准确的不足，为了解决如上的技术问题，本公开提出了一种大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂及检测方法。

本公开的一种典型实施方式，提供了一种大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂，由二氯甲烷、甲醇、乙酸组成，二氯甲烷、甲醇、乙酸的体积比为10～11:1～2:0.1～0.2。

本公开通过实验表明，本公开的展开剂能够将黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷在13cm的展距中完全展开。

该实施方式的一种或多种实施例中，二氯甲烷、甲醇、乙酸的体积比为10:2:0.1。

本公开的另一种实施方式，提供了一种大豆异黄酮苷的薄层层析检测方法，提供上述大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂，将待测样品点于薄层硅胶板，将点有待测样品的薄层硅胶板放置在含有上述大豆异黄酮苷的薄层层析展开剂的展缸中，进行上行展开，利用薄层扫描仪对展开后的薄层硅胶板进行扫描检测。

本公开的检测方法能够对大豆异黄酮苷中的黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷进行准确定量分析。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述薄层硅胶板为薄层层析硅胶板gf254。该硅胶板的分离效果更好。

该实施方式的一种或多种实施例中，将待测样品和标准品均点与薄层硅胶板。方便对待测样品中各种大豆异黄酮苷的分辨。

该系列实施例中，标准品的制备方法为将黄豆黄苷、大豆苷或染料木苷溶于甲醇中进行定容。

该系列实施例中，黄豆黄苷的标准品的浓度为1.55～1.60mg/ml。

该系列实施例中，大豆苷的标准品的浓度为1.15～1.20mg/ml。

该系列实施例中，染料木苷的标准品的浓度为1.05～1.10mg/ml。

该实施方式的一种或多种实施例中，在上行展开之前，进行预平衡。进行预平衡的目的是减少拖尾现象，从而增加检测的准确性。

该系列实施例中，所述预平衡的时间为20～25min。

该实施方式的一种或多种实施例中，扫描检测采用的扫描速度为70～90nm/s。

该实施方式的一种或多种实施例中，扫描检测采用的分辨率为150～250μm/step。

该实施方式的一种或多种实施例中，扫描检测采用的照射灯为d2灯。

该实施方式的一种或多种实施例中，扫描检测采用的检测波长为260nm。

该实施方式的一种或多种实施例中，扫描检测采用的扫描宽度为6.00mm*0.90mm。

该实施方式的一种或多种实施例中，黄豆黄苷rf值为0.50。

该实施方式的一种或多种实施例中，大豆苷rf值为0.41。

该实施方式的一种或多种实施例中，染料木苷rf值为0.52。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1检测方法

1.1原料和仪器

原料：豆浆水一级浮渣粉(山东禹王生态食业有限公司)；二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙酸、丙酮(天津富宇精细化工有限公司)，分析纯。

仪器：恒温水浴锅(江苏省金坛市正基仪器有限公司)，hh-s型。薄层扫描仪(wincats1.4.4)软件(瑞士camag公司)，camagtlcscanneriii型。凝胶成像仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，jy02g型。eyela-旋转蒸发仪(日本产)。

1.2方法

1.2.1提取及样品处理

将100g豆浆水一级浮渣粉和700ml丙酮加入蒸馏瓶，沸腾蒸馏1.5h。滤纸过滤，滤液在50℃旋转蒸发至干，干物质量为0.48g。

1.2.2标准品溶液的配置

用甲醇分别将黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆素定溶为1.58mg/ml、1.18mg/ml、1.09mg/ml、0.32mg/ml、1.38mg/ml。用乙酸乙酯将染料木素定溶为1.04mg/ml。1.2.3薄层层析扫描方法

1)苷(大豆苷，染料木苷，黄豆黄苷)

将样品液和标准液点于同一块高效薄层硅胶板gf254(10cm×20cm)上，展开剂：二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:2:0.1，预平衡20min，将板放入展开缸，上行展开，展开距：13cm。

扫描条件：扫描速度80nm/s，分辨率200μm/step，照射灯d2灯，波长260nm，扫描宽度6.00mm*0.90mm。

2)苷元(大豆苷元，染料木素，黄豆黄素)

将样品液和标准液点于同一块高效薄层硅胶板gf254(10cm×20cm)上，展开剂：三氯甲烷：甲醇：乙酸＝93:7:0.5，预平衡20min，将板放入展开缸，上行展开，展开距：13cm。

扫描条件：扫描速度80nm/s，分辨率200μm/step，照射灯d2灯，波长260nm，扫描宽度6.00mm*0.90mm。

1.2.4标准曲线的制备

精密取大豆异黄酮标准溶液，以梯度点样量点于同一高效薄层硅胶板gf254(10cm×20cm)上，以上述方法进行展开、扫描。以大豆异黄酮标准品的质量(μg)为横坐标(x)，峰面积积分值为纵坐标(y)，由薄层色谱仪管理软件wincats1.4.4直接得到线性回归方程。

1.2.5精密度测定

精密吸取样品溶液10μl，于同一高效薄层硅胶板gf254(10cm×20cm)上点5个点，依照上述薄层层析扫描方法测得其峰面积积分值。

1.2.6重复性

精密吸取10μl样品液，在5块高效薄层硅胶板gf254(10cm×20cm)上分别点样，依照上述薄层层析扫描方法测得其峰面积积分值。

1.2.7稳定性

精密吸取10μl样品液，在高效薄层硅胶板gf254(10cm×20cm)上点样，层析，依照上述薄层层析扫描方法测定不同时间段的各部分峰面积积分值。

1.2.8回收率

精密吸取已知含量的样品液3份，各10μl，分别点于3块高效薄层硅胶板gf254(10cm×20cm)上，在3点上分别加大豆异黄酮标准品(分别为样品液含量的50％、100％、150％)，充分混匀后依照上述薄层层析扫描方法，记录峰面积积分值，计算含量。

2结果

2.1六种大豆异黄酮和样品的薄层扫描结果

图1可知，黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷的rf值分别为：0.50、0.41、0.52，样品相对应的峰a、b的rf分别为0.45、0.55，由此可知峰a对应大豆苷，峰b则对应黄豆黄苷和染料木苷。对此展开区间内各峰进行全波长扫描，得图2。由图2可知，样品峰b与染料木苷相对应，样品中无峰与黄豆黄苷峰图吻合。综上所述，样品中检测到大豆苷与染料木苷，未检测到黄豆黄苷。

图3可知，黄豆黄素、大豆苷元、染料木素的rf值分别为：0.52、0.31、0.50，样品相对应的峰a、b的rf分别为0.35、0.52，由此可知峰a对应大豆苷元，峰b则对应黄豆黄素和染料木素。对此展开区间内各峰进行全波长扫描，得图4。由图4可知，样品峰b与染料木素相对应，样品中无峰与黄豆黄苷峰图吻合。综上所述，样品中检测到大豆苷元与染料木素，未检测到黄豆黄素。

2.2样品中六种大豆异黄酮含量分析

对硅胶板进行薄层层析扫描，得到六种大豆异黄酮的标准曲线方程，各标准品在试验范围内线性关系良好，r值均大于0.999，rsd值均小于2％。表1可知，豆浆水一级浮渣中黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆素、染料木素的含量分别为0、126.75mg/100g、48mg/100g、0、96.47mg/100g、179.34mg/100g。豆浆水一级浮渣中大豆异黄酮总量为450.56mg/100g。

表1六种大豆异黄酮标准品标准曲线方程及其在样品中含量

2.3精密度、重复性、稳定性和回收率测定结果

表2豆浆水一级汽浮渣中大豆异黄酮的精密度、重复性和稳定性测定结果

表2可知，精密度试验中标准品峰面积值的rsd值均小于2％，说明仪器精密度良好；对样品的5次平持稳定。样品的平均回收率为102.2％。

表3豆浆水一级汽浮渣中大豆异黄酮薄层层析回收率

由表3可知，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的平均加样回收率分别为99.32％、98.75％、100.06％、98.80％。

另外，通过实验证明：三氯甲烷：甲醇：乙酸＝93:7:0.5的展开剂无法对大豆苷、染料木苷、黄豆黄苷进行展开；二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:2:0.1的展开剂无法对大豆苷元、染料木素、黄豆黄素进行展开。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。