本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和光电化学传感器领域，硫化铟硫化镉共敏化铈掺杂二氧化钛的光电化学17β-雌二醇适体传感器制备方法。
背景技术：
17β-雌二醇是一种亲脂性、低分子量的类固醇激素，是环境内分泌干扰物中最具雌激素活性的一类，微量即能影响人正常的内分泌系统。17β-雌二醇可以通过很多途径进入到环境中，例如，病理治疗，饲料添加剂，未代谢完全的排泄物等，过量的17β-雌二醇会随食物链传递至人体并在人体内蓄积，导致发育异常、患生殖疾病和乳腺癌等的几率大大增加，对人体造成不可逆的损伤。因此，建立具有高灵敏度、操作简便的17β-雌二醇检测方法已经引起科研工作者们的关注。
目前，用于17β-雌二醇的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、电喷雾质谱法等。然而，这些检测方法存在操作复杂，提取过程耗时、仪器昂贵，有毒有害试剂的使用等缺点，并且短时间内无法解决。本发明提供了一种快速、简便、灵敏度和选择性高的光电化学适体传感器检测方法，具有时时在线检测，仪器操作便捷，特异性高，检测范围宽等优点。光电化学传感由于其具有独立的激发和发射信号，背景信号低，检测范围广，响应速度快，易于小型化等优点，已经被广泛用于检测中。与其他检测物相比，内分泌干扰物类通常具有较小的分子量，不易于被生物抗体捕获。适体作为一种化学抗体，是一段特定的dna或rna序列，能够准确地捕获目标物并且与其特异性结合。而且与抗体相比，适体更易于修饰，构型多变，能够检测的目标物范围更广，已经发展成为非常有潜力的抗体替代物。将光电化学的方法与适体的优势相结合，在检测小分子物质方面具有高灵敏度和易检测性，应用前景广阔。
本发明成功构建了可见光激发下检测17β-雌二醇的光电化学适体传感器。该传感器以铈掺杂的二氧化钛/硫化铟/硫化镉为基底，其匹配的导带位置和适合的带隙宽度大大提高了光生电子的转移速率，产生强光电流信号。再加上，特定序列的适体被用于捕获17β-雌二醇并将其固定到电极表面，引起光电流响应的变化并实现检测。该光电化学17β-雌二醇适体传感器具有低成本、高灵敏、特异性好、检测快速、制备过程简单等优点，在可见光区域实现了实现对的超灵敏检测，有效克服了目前17β-雌二醇检测方法的不足。
技术实现要素：
本发明目的之一是以硝酸铈作为铈源合成铈掺杂的二氧化钛作为光敏材料，引入新的能级，改变电子传递路径，减少电子空穴复合率。
本发明的目的之二是成功利用硫化铟和硫化镉共同敏化铈掺杂的二氧化钛作为基底材料，三者具有匹配的能级，利于光生电子的迅速转移，光电性能大大提升，构建光电化学17β-雌二醇适体传感器。
本发明的目的之三是提供了一种硫化铟硫化镉共敏化铈掺杂二氧化钛的光电化学17β-雌二醇适体传感器制备方法，实现了对17β-雌二醇的超灵敏检测。
本发明的技术方案如下：
1.一种硫化铟和硫化镉共敏化铈掺杂二氧化钛的光电化学17β-雌二醇适体传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
（a）铈掺杂二氧化钛的制备：
量取1~2ml钛酸正丁酯溶于40~80ml乙醇中得到溶液a；称取1.6~9.3mg硝酸铈水合物溶于水中得到溶液b；将溶液a在室温下逐滴滴入至溶液b中，剧烈搅拌30min后转移至反应釜中，160~180°c下反应12~24h，反应结束后，自然降至室温，用乙醇和去离子水清洗多次，50~80°c下烘干，得到铈掺杂的二氧化钛纳米颗粒；
（b）硫化铟的制备
称取0.1~0.2g氯化铟和0.3~0.4g九水合硫化钠超声溶于50ml去离子水中并且磁力搅拌30min得到乳白色溶液并转移至100ml反应釜中，于160~200°c下反应16~24h，冷却至室温后得到的黄色固体用大量乙醇洗涤后，置于真空干燥箱中在50~80°c下干燥过夜；
（c）硫化镉的制备
取0.2~0.4g九水合硫化钠溶解于10~30ml超纯水中，取0.2~0.5g乙酸镉溶解于10~40ml超纯水中；将两溶液混合均匀后，转入反应釜中，在160~200°c条件下水热反应20~24h；冷却至室温后，所得产物用无水乙醇和超纯水各洗涤3次；在50~80°c下真空干燥12~24h，制得硫化镉量子点；
（d）将氧化铟锡ito电极切割至2.5cm×0.8cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30~40min，用氮气吹干；
（e）将8~10µl浓度为5mg/ml的铈掺杂二氧化钛ce:tio2溶液修饰到ito电极上，室温下晾干，然后在400~450°c马弗炉中煅烧30~60min，取出后自然冷却至室温；
（f）在电极表面依次修饰6~8μl浓度为5~8mg/ml的硫化铟in2s3溶液和6~8μl浓度为5~8mg/ml硫化镉cds溶液，并在室温下自然晾干；
（g）在ito/ce:tio2/in2s3/cds电极表面修饰4~6μl巯基乙酸，自然晾干并用超纯水冲洗，在修饰电极表面滴加体积比为1:1的10mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和5mg/mln-羟基琥珀酰亚胺的混合液4~6μl用于辅助缩合反应；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
（h）进一步修饰4~6μl浓度为1~2µm的氨基化17β-雌二醇适体并在4°c下孵育4~6h，使适体上的氨基与巯基乙酸上的羧基反应并固定到电极表面，用超纯水洗涤去除未结合的17β-雌二醇适体，室温下晾干；
（i）修饰3~5µl6-巯基-己-1-醇以封闭非特异性结合位点，室温下反应1~2h，用超纯水洗涤，室温下晾干；
（j）滴加6~8µl不同浓度的17β-雌二醇溶液，室温下孵育1~2h，通过目标物与适体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面，再用超纯水清洗多余的17β-雌二醇，4°c冰箱中晾干，即制得光电化学17β-雌二醇适体传感器；
2.光电化学传感器的检测方法如下：
（a）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的17β-雌二醇标准溶液；
（b）工作电极修饰：将所制备的光电化学17β-雌二醇适体传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的17β-雌二醇标准溶液分别滴涂到工作电极上；
（c）工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在pbs缓冲溶液中进行测试；采用i-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0v，运行时间120s，光源波长为400~450nm；检测对不同浓度的17β-雌二醇标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的17β-雌二醇标准溶液的光电流强度记为ii，ii与17β-雌二醇标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制ii-logc工作曲线；
（d）17β-雌二醇的检测：用待测的实验室水龙头的自来水和湖水代替步骤b中的17β-雌二醇标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度i和工作曲线，得到待测样品中17β-雌二醇的含量；
所述的pbs缓冲溶液为10ml、ph为5.0~8.0的含0.1mol/l抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
本发明的有益成果
（1）本发明成功地合成了铈掺杂的二氧化钛纳米材料并在原有的二氧化钛带隙中引入新的能级，大大减少了电子空穴复合率，有利于光电化学17β-雌二醇适体传感器的分析检测；
（2）本发明成功合成了硫化铟和硫化镉量子点并对铈掺杂的二氧化钛纳米材料进行敏化，获得了极好的光电性能，这是首次硫化铟材料被用于光电化学传感器的制备中。三者之间良好的能级匹配，实现了更高的光电转化效率；
（3）本发明成功构建了一种硫化铟硫化镉共敏化铈掺杂二氧化钛的光电化学17β-雌二醇适体传感器，其操作简单、信号响应范围宽，实现了对17β-雌二醇适体的高灵敏检测。
实施案例1铈掺杂二氧化钛的制备
量取1ml钛酸正丁酯溶于40ml乙醇中得到溶液a；称取9.3mg硝酸铈水合物溶于水中得到溶液b；将溶液a在室温下逐滴滴入至溶液b中，剧烈搅拌30min后转移至反应釜中，180°c下反应12h。反应结束后，自然降至室温，用乙醇和去离子水清洗多次，80°c下烘干，得到铈掺杂的二氧化钛纳米颗粒。
实施案例2铈掺杂二氧化钛的制备
量取1ml钛酸正丁酯溶于40ml乙醇中得到溶液a；称取3.1mg硝酸铈水合物溶于水中得到溶液b；将溶液a在室温下逐滴滴入至溶液b中，剧烈搅拌30min后转移至反应釜中，180°c下反应12h。反应结束后，自然降至室温，用乙醇和去离子水清洗多次，80°c下烘干，得到铈掺杂的二氧化钛纳米颗粒。
实施案例3铈掺杂二氧化钛的制备
量取1ml钛酸正丁酯溶于40ml乙醇中得到溶液a；称取1.6mg硝酸铈水合物溶于水中得到溶液b；将溶液a在室温下逐滴滴入至溶液b中，剧烈搅拌30min后转移至反应釜中，180°c下反应12h。反应结束后，自然降至室温，用乙醇和去离子水清洗多次，80°c下烘干，得到铈掺杂的二氧化钛纳米颗粒。
实施案例4硫化铟的制备
称取0.1106g氯化铟和0.3603g九水合硫化钠超声溶于50ml去离子水中并且磁力搅拌30min得到乳白色溶液并转移至100ml反应釜中，于180°c下反应16h。冷却至室温后得到的黄色固体用大量乙醇洗涤后，置于真空干燥箱中在50°c下干燥过夜。
实施案例5硫化镉的制备
称取0.3g九水合硫化钠溶解于10ml超纯水中，取0.4g乙酸镉溶解于10ml超纯水中；将两溶液混合均匀后，转入反应釜中，在160°c条件下水热反应20h；冷却至室温后，所得产物用无水乙醇和超纯水各洗涤3次；在40°c下真空干燥12h，制得硫化镉量子点。
实施案例6光电化学17β-雌二醇适体传感器的制备
（a）将氧化铟锡ito电极切割至2.5cm×0.8cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，用氮气吹干；
（b）将10µl浓度为5mg/ml的铈掺杂二氧化钛溶液修饰到ito电极上。室温下晾干，然后在450°c马弗炉中煅烧30min，取出后自然冷却至室温；
（c）在电极表面依次修饰6μl浓度为5mg/ml的硫化铟水溶液和6μl浓度为5mg/ml硫化镉溶液，并在室温下自然晾干，得到ito/ce:tio2/in2s3/cds电极；
（d）在ito/ce:tio2/in2s3/cds电极表面修饰4μl巯基乙酸，自然晾干并用超纯水冲洗，在修饰电极表面滴加体积比为1:1的10mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和5mg/mln-羟基琥珀酰亚胺的混合液6μl用于辅助缩合反应；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
（e）在电极表面进一步修饰6μl浓度为1µm的氨基化17β-雌二醇适体并在4°c下孵育4h，使适体上的氨基与巯基乙酸上的羧基反应并固定到电极表面，用超纯水洗涤去除未结合的17β-雌二醇适体，室温下晾干；
（f）电极表面修饰3µl6-巯基-己-1-醇以封闭非特异性结合位点，室温下反应1h，用超纯水洗涤，室温下晾干；
（g）电极表面滴加6µl不同浓度的17β-雌二醇溶液，室温下孵育1h，通过目标物与适体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面，再用超纯水清洗多余的17β-雌二醇，4°c冰箱中晾干，即制得光电化学17β-雌二醇适体传感器。
实施案例7光电化学17β-雌二醇适体传感器的制备：
（a）将氧化铟锡ito电极切割至2.5cm×0.8cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，用氮气吹干；
（b）将10µl浓度为5mg/ml的铈掺杂二氧化钛溶液修饰到ito电极上。室温下晾干，然后在400°c马弗炉中煅烧60min，取出后自然冷却至室温，得到ito/ce:tio2电极；
（c）电极表面依次修饰6μl浓度为5mg/ml的硫化铟水溶液和硫化镉溶液，并在室温下自然晾干，得到ito/ce:tio2/in2s3/cds电极；
（d）在ito/ce:tio2/in2s3/cds电极表面修饰4μl巯基乙酸，自然晾干并用超纯水冲洗，在修饰电极表面滴加体积比为1:1的10mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和5mg/mln-羟基琥珀酰亚胺的混合液6μl用于辅助缩合反应；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
（e）电极表面进一步修饰6μl浓度为1µm的氨基化17β-雌二醇适体并在4°c下孵育4h，使适体上的氨基与巯基乙酸上的羧基反应并固定到电极表面，用超纯水洗涤去除未结合的17β-雌二醇适体，室温下晾干；
（f）电极表面修饰3µl6-巯基-己-1-醇以封闭非特异性结合位点，室温下反应1h，用超纯水洗涤，室温下晾干；
（g）电极表面滴加6µl不同浓度的17β-雌二醇溶液，室温下孵育1h，通过目标物与适体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面，再用超纯水清洗多余的17β-雌二醇，4°c冰箱中晾干，即制得光电化学17β-雌二醇适体传感器。
实施案例8光电化学17β-雌二醇适体传感器的制备
（a）将氧化铟锡ito电极切割至2.5cm×0.8cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，用氮气吹干；
（b）将10µl浓度为5mg/ml的铈掺杂二氧化钛溶液修饰到ito电极上。室温下晾干，然后在450°c马弗炉中煅烧30min，取出后自然冷却至室温，得到ito/ce:tio2电极；
（c）电极表面依次修饰6μl浓度为5mg/ml的硫化铟水溶液和硫化镉溶液，并在室温下自然晾干，得到ito/ce:tio2/in2s3/cds电极；
（d）在ito/ce:tio2/in2s3/cds电极表面修饰4μl巯基乙酸，自然晾干并用超纯水冲洗，在修饰电极表面滴加体积比为1:1的10mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和5mg/mln-羟基琥珀酰亚胺的混合液6μl用于辅助缩合反应；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
（e）电极表面进一步修饰6μl浓度为2µm的氨基化17β-雌二醇适体并在4°c下孵育4h，使适体上的氨基与巯基乙酸上的羧基反应并固定到电极表面，用超纯水洗涤去除未结合的17β-雌二醇适体，室温下晾干；
（f）电极表面修饰3µl6-巯基-己-1-醇以封闭非特异性结合位点，室温下反应1h，用超纯水洗涤，室温下晾干；
（g）电极表面滴加6µl不同浓度的17β-雌二醇溶液，室温下孵育1h，通过目标物与适体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面，再用超纯水清洗多余的17β-雌二醇，4°c冰箱中晾干，即制得光电化学17β-雌二醇适体传感器。
实施案例917β-雌二醇的检测
a.标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的17β-雌二醇标准溶液；
b.工作电极修饰：将所制备的光电化学17β-雌二醇适体传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的17β-雌二醇标准溶液分别滴涂到工作电极上；
c.工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在pbs缓冲溶液中进行测试；采用i-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0v，运行时间120s，光源波长为400nm；检测对不同浓度的17β-雌二醇标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的17β-雌二醇标准溶液的光电流强度记为ii，ii与17β-雌二醇标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制ii-logc工作曲线；
所述的pbs缓冲溶液为10ml、ph为7.4的含0.1mol/l抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
实施案例1017β-雌二醇的检测
a.标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的17β-雌二醇标准溶液；
b.工作电极修饰：将所制备的光电化学17β-雌二醇适体传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的17β-雌二醇标准溶液分别滴涂到工作电极上；
c.工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在pbs缓冲溶液中进行测试；采用i-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0v，运行时间120s，光源波长为450nm；检测对不同浓度的17β-雌二醇标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的17β-雌二醇标准溶液的光电流强度记为ii，ii与17β-雌二醇标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制ii-logc工作曲线；
所述的pbs缓冲溶液为10ml、ph为7.4的含0.1mol/l抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。