一种噬菌体透射电镜标本的制备方法与流程

本发明公开一种噬菌体透射电镜标本的制备方法，属于噬菌体标本制备技术领域。

背景技术：

噬菌体是在1907年和1909年分别由twort和d，herelle各自独立发现。噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在。在人和动物的排泄物或污染的井水、河水中，常含有肠道菌的噬菌体。在土壤中，可找到土壤细菌的噬菌体；噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内，故可利用噬菌体进行细菌的流行病学鉴定与分型，以追查传染源。由于噬菌体结构简单、基因数少，是分子生物学与基因工程的良好实验系统。在噬菌体研究过程中，鉴定该噬菌体的形态是前提条件，目前国内外研究报道噬菌体的形态鉴定方法有很多，主要集中在应用不同类型的电镜检查上，对于噬菌体标本的如何制备相对较少，且大部分用时过长，标本及试剂用量大，为此寻找到了一种高质量的噬菌体透射电镜标本制备方法是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种噬菌体透射电镜标本的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将经纯化后的噬菌体进行复壮，使效价达10⁶以上。

(2)将宿主菌铺双层平板上培养，然后滴加步骤(1)所得噬菌体5～15μl，待全部吸收后，相同温度条件下继续培养到噬菌斑透亮即可。

(3)抠下含有噬菌斑的上层琼脂放入装有(100～200μl)的生理盐水或噬菌体存储液的离心管中捣碎，4℃放置2h(充分使噬菌体释放富集)，离心处理后，吸取上清液；取噬菌体液滴时，尽量不要吸取到琼脂，否则会造成杂质过多，后续电镜观察难度大，无法观察到噬菌体。

(4)滴加1滴50～100μl步骤(3)得到的噬菌体上清液到膜(例如封口膜或干净的薄膜手套)上，从铜网盒中镊取一片铜网，正面向上放入噬菌体液滴中，同时开始计时1～2min；放、拿、开铜网盒时动作要轻，特别开铜网盒时，尤其注意，否则铜网很容易被震出；镊取铜网时，尽量接触边缘位置，动作要轻柔，否则会造成铜网大面积破损，标本不可用；镊取不同的铜网之前要注意镊子的清洁，防止噬菌体间相互污染。

(5)2min后，取出铜网(铜网即为200目碳支持膜)，让其自然吸收20s～30s(即置于空气中直接干燥)，用吸水纸轻轻吸取剩余噬菌体液；然后用50～200μl生理盐水或经高压灭菌的纯水洗涤，并用吸水纸轻轻吸去液滴。

(6)正面向上放入第1滴醋酸铀染液中(只需要染液将铜网全部浸泡即可，一般添加20μl)，染色1～2min，取出后迅速用吸水纸吸取残留的染液，并用50～200μl生理盐水或经高压灭菌的纯水洗涤，吸去液滴；染色时铜网没入液滴，同时严格控制染色时间，特别是在醋酸铀染液中的时间，时间快到时，提前做好准备，镊住铜网，时间一到即取出；染色时间过短或过长，都不利于结果观察。

(7)正面向上放入另1滴醋酸铀染液中(只需要染液将铜网全部浸泡即可，一般添加20μl)，染色1～2min，取出，吸去残留染液，放回铜网盒，同时标记好位置；染色完成，放回铜网盒时要注意标记正面，最好是正面朝向有字母一侧，后续电镜观察正面较好。

优选的，本发明步骤(1)中噬菌体的效价为10⁸以上，噬菌体纯度及效价高，效果会更好，若噬菌体效价达不到，噬斑不够透亮，可扣下噬斑单斑增菌后再次滴加。

优选的，本发明步骤(1)中复壮条件为：温度18～37℃，转速100～220rpm，时间6～24h。

优选的，本发明步骤(2)中培养的条件为：18～37℃培养6～24h。

优选的，本发明步骤(3)中离心处理的条件为：转速为5000rpm，离心处理时间为2min。

本发明的有益效果：

(1)传统方法试剂用量大，且需要特殊的离心机，费时费力费钱，本发明所述方法大大节约了人力物力与成本，适合于大规模电镜标本的制备观察。

(2)传统方法1周才能制备10份样品，本发明所述方法2天可以制备100份样品，通量高，且同时可观察到噬菌体与宿主的作用情况，即扩即用，能确保噬菌体处于新鲜状态下的形态。

附图说明

图1为鼠疫菌噬菌体的电镜下形态图；

图2为电镜下噬菌体特殊结构图；

图3为电镜下噬菌体正在吸附宿主菌图；

图4为电镜下噬菌体穿入宿主菌内部。

具体实施方式

下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

一种噬菌体透射电镜标本的制备方法，以鼠疫噬菌体为例进一步说明，具体包括以下步骤：

(1)把4℃保存的纯化野生鼠疫噬菌体，经28℃，220rpm，24h复壮后，测其效价，效价达10⁸以上，进行下一步的标本制备工作。

(2)将宿主菌ev76(鼠疫疫苗株)铺双层平板，28℃培养1.5h，滴加上述噬菌体15μl，待全部吸收后，继续放28℃培养噬菌斑透亮即可。

(3)用10μl枪头抠下含有噬菌斑的上层琼脂放入200μl生理盐水(或sm液)的1.5ml离心管中捣碎，4℃放置2h，5000rpm，2min，吸取上清液。

(4)准备一张封口膜或干净的薄膜手套，滴加1滴100μl经富集、离心的噬菌体上清液，准备两滴各20μl的醋酸铀染液后续步骤使用。

(5)用专用镊子从铜网盒中镊取一片铜网，正面向上放入噬菌体液滴中，同时开始计时2min；严格控制时间。

(6)2min后，取出铜网，让其自然吸收30s，用吸水纸轻轻吸取剩余噬菌体液；然后用200μl生理盐水或经高压灭菌的纯水洗涤，并用吸水纸轻轻吸去液滴。

(7)正面向上放入第1滴醋酸铀染液中，严格染色2min；取出后迅速用吸水纸吸取残留的染液，并用200μl生理盐水或经高压灭菌的纯水洗涤，吸去液滴。

(8)正面向上放入另1滴醋酸铀染液中，严格染色2min，取出，吸去残留染液，放回铜网盒，同时标记好位置得到噬菌体透射电镜标本，如图1所示；从图中可以清晰观察到此噬菌体为肌尾型噬菌体，即头部为二十面体，尾部为可伸缩的肌尾结构。

实施例2

一种噬菌体透射电镜标本的制备方法，以大肠杆菌atcc8739为例进一步说明，具体包括以下步骤：

(1)把4℃保存的纯化大肠杆菌噬菌体，经37℃，220rpm，24h复壮后，测其效价，效价需达10⁸以上，才可进行下一步的标本制备工作。

(2)将宿主菌(大肠杆菌atcc8739)铺双层平板，37℃培养3h，滴加上述噬菌体15μl，待全部吸收后，继续放37℃培养噬菌斑透亮即可。

(3)用10μl枪头抠下含有噬菌斑的上层琼脂放入200μl生理盐水(或sm液)的1.5ml离心管中捣碎，4℃放置2h，5000rpm，2min，吸取上清液。

(4)准备一张封口膜或干净的薄膜手套，滴加1滴100μl经富集、离心的噬菌体上清液，准备两滴各20μl的醋酸铀染液后续步骤使用。

(5)用专用镊子从铜网盒中镊取一片铜网，正面向上放入噬菌体液滴中，同时开始计时1.5min，严格控制时间。

(6)1.5min后，取出铜网，让其自然吸收20s，用吸水纸轻轻吸取剩余噬菌体液；然后用100μl生理盐水或经高压灭菌的纯水洗涤，并用吸水纸轻轻吸去液滴。

(7)正面向上放入第1滴醋酸铀染液中，严格染色1.5min，取出后迅速用吸水纸吸取残留的染液，并用100μl生理盐水或经高压灭菌的纯水洗涤，吸去液滴。

(8)正面向上放入另1滴醋酸铀染液中，严格染色1.5min，取出，吸去残留染液，放回铜网盒，同时标记好位置得到噬菌体透射电镜标本。

实施例3

一种噬菌体透射电镜标本的制备方法，以金黄色葡萄球菌atcc25923为例进一步说明，具体包括以下步骤：

(1)把4℃保存的纯化金黄色葡萄球菌噬菌体，经37℃，220rpm，24h复壮后，测其效价，效价需达10⁸以上，才可进行下一步的标本制备工作。

(2)将宿主菌(金黄色葡萄球菌atcc25923)铺双层平板，37℃培养1～3h左右，滴加上述噬菌体15μl，待全部吸收后，继续放37℃培养噬菌斑透亮即可。

(3)用10μl枪头抠下含有噬菌斑的上层琼脂放入200μl生理盐水(或sm液)的1.5ml离心管中捣碎，4℃放置2h，5000rpm，2min，吸取上清液。

(4)准备一张封口膜或干净的薄膜手套，滴加1滴100μl经富集、离心的噬菌体上清液，准备两滴各20μl的醋酸铀染液后续步骤使用。

(5)用专用镊子从铜网盒中镊取一片铜网，正面向上放入噬菌体液滴中，同时开始计时2min，严格控制时间。

(6)2min后，取出铜网，让其自然吸收30s左右，用吸水纸轻轻吸取剩余噬菌体液；然后用200μl生理盐水或经高压灭菌的纯水洗涤，并用吸水纸轻轻吸去液滴。

(7)正面向上放入第1滴醋酸铀染液中，严格染色2min，取出后迅速用吸水纸吸取残留的染液，并用200μl生理盐水或经高压灭菌的纯水洗涤，吸去液滴。

(8)正面向上放入另1滴醋酸铀染液中，严格染色2min，取出，吸去残留染液，放回铜网盒，同时标记好位置得到噬菌体透射电镜标本。

用本发明所述方法制备得到的电镜标本去观察场分离鼠疫菌噬菌体的电镜图片，从图中可以清晰观察到此噬菌体为长尾型噬菌体，即头部为二十面体，尾部为可长尾结构，尾端有基座，基座上长有尾丝，如图2所示。

用本发明所述方法制备得到的电镜标本去观察现场分离鼠疫菌噬菌体正在侵染鼠疫菌的电镜图片，从图中可以清晰观察到许多噬菌体吸附到了细菌表面，如图3所示。

用本发明所述方法制备得到的电镜标本去观察现场分离鼠疫菌噬菌体正在刺入鼠疫菌的电镜图片，从图中可以清晰观察到许多噬菌体将长尾刺入了细菌内部，如图4所示。

本发明实施例1～3制备得到的透射电镜标本，节约人力﹑物力和时间，电子显微镜下标本的背景清晰，有利于噬菌体的整体形态观察，用该方法制备噬菌体电镜标本对于噬菌体的特殊结构和噬菌体与宿主菌相互作用(吸附﹑穿入)的阶段观察，往往有比较好的效果。