一种检测风疹病毒IgM抗体的化学发光免疫分析试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法与测试方法。

背景技术：

风疹病毒(rubellavirus)是披膜病毒科，风疹病毒属的唯一成员，人是其唯一的自然宿主。风疹疾病本身并不严重，但风疹病毒对公众健康最大的威胁是它的致畸性。孕妇感染风疹病毒可对婴儿产生先天性损害，尤其是妊娠前3个月若感染风疹病毒，病毒可经血液感染胎儿，导致自发流产、死产或胎儿感染，从而引起胎儿严重的出生缺陷：包括白内障、耳聋、心脏病和智力低下等，称为先天性风疹综合征(congenitalrubellasyndromes,crs)。风疹病毒可以通过接种疫苗得到一定程度的预防，但一旦感染，目前尚无特效的治疗方式，因此在临床上对风疹病毒的感染、实验室诊断及其流行特征极为重视。

风疹特异抗体检测可用于判定个体免疫状态，有助于提示个体既往感染的血清学状况和诊断及预防急性风疹感染。个体感染风疹病毒后，体液免疫反应首先产生以igm为主的免疫球蛋白，随后igm抗体浓度下降，因此，抗rubellaigm的检测可作为风疹病毒感染早期诊断的指标；rubellaigm抗体可在大部分的风疹病毒急性病毒感染中检测到，其对孕龄妇女鉴别是否为急性、新近或复发感染具有重要意义。

目前常用的检测风疹病毒igm抗体的方法有放射免疫技术(ria)、酶联免疫分析技术(elisa)及免疫印迹法(wb)，但ria存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤、操作繁琐、检测时间长等缺点；elisa具有灵敏度低、检测范围窄、检测时间长、重复性差等；免疫印迹法试剂需要低温保存等。

本检测试剂盒为化学发光免疫分析法，该方法具有种操作简单，无放射性风险及其检测时间短，并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测；另一方面，风疹病毒igm化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供了一种检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒，包括试剂r1、试剂r2和试剂r3；

其中：

试剂r1为含磁珠包被抗人igm抗体的缓冲液，磁珠包被抗人igm抗体的浓度为0.5％～5％，所述磁珠的粒径是0.05～3μm；

试剂r2为含化学发光标记物标记的风疹病毒抗体的缓冲液，化学发光标记物标记的风疹病毒抗体的浓度为0.1～1.0μg/ml，抗体与标记物的标记比例是1:3～1:20；

试剂r3为风疹病毒抗原的缓冲液，风疹病毒抗原的浓度为0.1～2.0μg/ml。

优选地，试剂r1中的抗人igm抗体为抗人igm鼠单克隆抗体。

优选地，试剂r2中的风疹病毒抗体为风疹病毒e1蛋白单克隆抗体。

优选地，r2中的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。

优选地，r3中的风疹病毒抗原为灭活的风疹病毒。

优选地，试剂所用缓冲液及储存液为ph6.0～8.0的含有表面活性剂、防腐剂及蛋白的缓冲液；其中缓冲盐为柠檬酸盐、bistris丙烷或磷酸盐。

优选地，上述的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒，还包括2.0s/co和0.0s/co的校准品。

优选地，上述的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒，还包括2.0s/co和0.5s/co的质控品。

优选地，上述的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒，还包括化学发光底物液a液和b液，其中，a液为过氧化氢和硝酸溶液，b液为氢氧化钠溶液。

优选地，上述的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒，还包括清洗液，所述清洗液为pb缓冲液。

本发明的试剂盒测定原理是捕获法。样本与磁珠包被的抗人igm抗体r1溶液(40μl)和r3抗原溶液(50μl)共同孵育18min，清洗5min，再与吖啶酯标记风疹病毒抗体溶液(50μl)反应，形成磁微球-抗人igm抗体-风疹病毒igm抗体-风疹病毒-吖啶酯复合物，通过磁分离器分离免疫复合物，洗掉游离的成分。通过酸碱激发液激发吖啶酯发光，记录相对发光强度(rlu)，仪器(比较由样本反应产物获得的化学发光信号值和先前定标获得的cutoff值)自动计算检测结果。

本发明的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒用于rubellaigm抗体检测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对大量样本进行检测，通过统计学方法计算出公式，内置于射频卡；接着测试两点校准，对主校准曲线进行校准；接着测试质控品，质控品测试结果落在靶值范围内认为校准合格。测试实际临床样本，根据样本发光值计算样本浓度；样本的结果以有反应性或无反应性以及cutoff指数(样本信号值/cutoff值，s/co)表示，最后对风疹病毒igm抗体检测试剂盒进行性能的评价。

与现有技术相比，本发明的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒的有益效果为：

1、选择吖啶酯等为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，降低了本底空白，提高了灵敏度；不需要酶的参与，节约时间及成本。采用顺磁微粒作为固相载体，其比表面积大，进一步提高了检测的灵敏度。

2、风疹病毒igm抗体化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守。如可直接用于全自动生化分析仪上，无需大型仪器设备配合，成本较低，且无放射性污染，可大规模的开展和推广。

3、试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。化学发光免疫检测试剂盒在准确度方面可以替代市面上的elisa法等试剂盒，为客户提供更加快速、准确的测量数据。

4、这种风疹病毒igm抗体检测试剂盒中使用的校准品和质控品，均由其他商品化风疹病毒igm抗体检测试剂盒(雅培贸易(上海)有限公司生产的风疹病毒igm测定试剂盒)进行赋值保证了测试结果的准确度。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒的制备流程。

具体实施方式

本发明的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒包括试剂r1、试剂r2和试剂r3；

其中：

试剂r1为含磁珠包被抗人igm抗体的缓冲液，磁珠包被抗人igm抗体的浓度为0.5％～5％，所述磁珠的粒径是0.05～3μm；

试剂r2为含化学发光标记物标记的风疹病毒抗体的缓冲液，化学发光标记物标记的风疹病毒抗体的浓度为0.1～1.0μg/ml，抗体与标记物的标记比例是1:3～1:20；

试剂r3为风疹病毒抗原的缓冲液，风疹病毒抗原的浓度为0.1～2.0μg/ml。

其中，试剂r1、r2、r3的制备过程如图1所示，首先是对抗原抗体的筛选，之后分别进行磁珠包被抗体，化学发光标记物(如吖啶酯)标记抗体，配制抗原溶液，再根据磁珠包被抗体和化学发光标记物(如吖啶酯)标记抗体的浓度进行调配，最后试剂分装。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1本发明的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒

(1)风疹病毒igm抗体校准品、质控品的制备

取风疹病毒igm抗体的蛋白溶液，用商品化风疹病毒igm抗体检测试剂盒(雅培贸易(上海)有限公司生产的风疹病毒igm测定试剂盒)进行赋值，取赋值结果为5.0s/co的风疹病毒igm抗体蛋白溶液，用校准品基质稀释成2.0s/co，作为高浓度校准品。

取校准品基质赋值结果为0.0s/co，作为低浓度校准品。

取赋值结果为5.0s/co的风疹病毒igm抗体蛋白溶液，用质控品基质稀释成2.0s/co，作为高浓度质控品。

取赋值结果为5.0s/co的风疹病毒igm抗体蛋白溶液，用质控品基质稀释成0.5s/co，作为低浓度质控品。

(2)试剂r1的配制

将10mgtosyl磁珠(粒径0.05～3um)的溶液混匀，磁分离移除上清液，用0.02m的pb缓冲液清洗三次后重悬，加入0.05mg包被抗体，混匀，并在持续旋转混匀下，37℃孵育2～4h，磁分离去上清液用0.02m的pb缓冲液清洗三次后用20％赖氨酸进行封闭，磁分离去上清，使用储存缓冲液重悬磁珠，磁珠包被抗体浓度为0.5％，收集保存于2℃～8℃用于后续实验。

(3)试剂r2的配制

将500μg抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入0.75ml2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心20s。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀2h。加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为0.5h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分步收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存。使用时将纯化后的风疹病毒抗体浓溶液用100mmpb、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph8.0的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/ml，2℃～8℃保存。

(4)试剂r3的配制

将浓度0.1ug/ml的灭活风疹病毒溶于ph8.0磷酸盐缓冲液中，该缓冲液包含表面活性剂、防腐剂及蛋白，风疹病毒抗原的浓度为0.1μg/ml。

实施例2本发明的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒

(1)校准品及质控品的制备

同实施例1。

(2)试剂r1的配制

将10mgtosyl磁珠(粒径0.05～3um)的溶液混匀，磁分离移除上清液，用0.02m的pb缓冲液清洗三次后重悬，加入0.25mg包被抗体，混匀，并在持续旋转混匀下，37℃孵育2～4h，磁分离去上清液用0.02m的pb缓冲液清洗三次后用20％赖氨酸进行封闭，磁分离去上清，使用储存缓冲液重悬磁珠，磁珠包被抗体浓度为2.5％，收集保存于2℃～8℃用于后续实验。

(3)试剂r2的配制

将500μg抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心30s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入2.5ml2mg/ml鲁米诺的dmf溶液，用离心机室温条件下离心30s。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀3h。加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分步收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存。使用时将纯化后的风疹病毒抗体浓溶液用100mm柠檬酸、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.5μg/ml，2℃～8℃保存。

(4)试剂r3的配制

将浓度0.5ug/ml的灭活风疹病毒溶于ph6.5柠檬酸盐缓冲液中，该缓冲液包含表面活性剂、防腐剂及蛋白，风疹病毒抗原的浓度为1.0μg/ml。

实施例3本发明的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒

(1)校准品及质控品的制备

同实施例1。

(2)试剂r1的配制

将10mgtosyl磁珠(粒径0.05～3um)的溶液混匀，磁分离移除上清液，用0.02m的pb缓冲液清洗三次后重悬，加入0.5mg包被抗体，混匀，并在持续旋转混匀下，37℃孵育2～4h，磁分离去上清液用0.02m的pb缓冲液清洗三次后用20％赖氨酸进行封闭，磁分离去上清，使用储存缓冲液重悬磁珠，磁珠包被抗体浓度为5％，收集保存于2℃～8℃用于后续实验。

(3)试剂r2的配制

将500μg抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心40s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5ml2mg/ml三联吡啶钌的dmf溶液，用离心机室温条件下离心40s。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀4h。加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为2h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分步收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存。使用时将纯化后的风疹病毒抗体浓溶液用100mmbistris丙烷、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.0的缓冲液稀释至终浓度为1.0μg/ml，2℃～8℃保存。

(4)试剂r3的配制

将浓度2.0ug/ml的灭活风疹病毒溶于ph6.0bistris丙烷缓冲液中，该缓冲液包含表面活性剂、防腐剂及蛋白，风疹病毒抗原的浓度为2.0μg/ml。

实施例4本发明的检测风疹病毒igm抗体的化学发光免疫分析试剂盒性能评估

采用发明实施例1的检测风疹病毒igm抗体化学发光免疫分析试剂盒对风疹病毒igm抗体国家参考品(采购自中检院，批号：360006-201702)进行检测。

检测方法为：

以迪瑞全自动化学发光免疫分析仪(cm-180)为检测仪器，方法学为捕获法，样本量10μl，磁珠包被的抗人igm单克隆抗体试剂量40μl和风疹病毒抗原溶液试剂量50μl，化学发光物质标记的风疹病毒抗体试剂量50μl。首先，加入样本10μl，加入90μl稀释液，稀释10倍，然后分别加入r3、r1试剂孵育18min，洗涤5min(清洗液为pb缓冲液)，加入r2试剂孵育5min，洗涤5min(清洗液为pb缓冲液)。仪器将反应物送入暗室，一次加入发光激发液a液(h2o2和hno3溶液)和b液(naoh溶液)进行反应，最后记录相对发光强度(rlu)。仪器(比较由样本反应产物获得的化学发光信号值和先前定标获得的cutoff值)自动计算检测结果。

检测结果如下：

(1)阴性参考品符合率

用制备的试剂盒测定国家阴性参考品，结果如表1，测试结果均为阴性，与国家阴性参考品完全符合。

表1性参考品测定结果

(2)阳性参考品符合率

采用制备的试剂盒测定国家阳性参考品，结果如表2，测试结果均为阳性，与国家阳性参考品完全符合。

表2阳性参考品测定结果

(3)检测限参考品

采用制制的试剂盒测定国家检测限参考品，结果如表3，测试结果符合国家检测限参考品要求。

表3检测限参考品测定结果

(4)重复性参考品(r)

用本发明的试剂盒对国家参考品进行重复性检测，重复测定10次，计算10次测量结果的平均值和标准差sd，根据公式(1)计算变异系数(cv)不大于15％，测试结果如表4：变异系数为3.80％。

式中：cv—变异系数；

sd—测量结果的标准差；

—测量结果的平均值

表4重复性测定结果

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。