特定凝集素在基于唾液糖蛋白糖链鉴别糖尿病/非糖尿病肾病方面的应用的制作方法

本发明涉及一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别糖尿病肾病及非糖尿病肾病的标志物及其相关产品、应用。

背景技术：

随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，糖尿病发病率持续增高，其患病人数到2045年可能突破6.93亿。糖尿病肾病(diabeticnephropathy,dn)在糖尿病(diabetesmellitus,dm)患者中发生率高达20％～40％。研究表明，糖尿病患者出现肾脏病变不一定就是糖尿病肾病。众多研究发现有一部分糖尿病合并肾脏病的患者对不同治疗方案的敏感性与糖尿病肾病患者相比有所不同，为了将二者加以区别，称此类疾病为非糖尿病性肾脏疾病(non-diabeticrenaldisease,ndrd)，即原发性肾脏病患者同时存在糖尿病，但未造成继发性糖尿病性肾损害。由于糖尿病肾病(dn)与非糖尿病性肾脏疾病(ndrd)并非同一类型的疾病，其病理特征、临床表现、治疗反应、病情进展速度和预后均有所不同，因此对其进行准确鉴别诊断尤为重要(少数存在dn和ndrd并存的情况，但非常罕见，且治疗方案与单独的dn和ndrd相比无显著差异，故本研究暂不考虑)。鉴别dn和ndrd的金标准是肾活检穿刺，但因其有创、费用高、技术条件要求高等局限性而不能常规开展，故临床工作中亟需一个简单易行、稳定可靠的鉴别方法。

糖基化是一种重要的翻译后修饰，研究发现超过半数的哺乳动物体内的蛋白质为糖蛋白。糖基化对糖蛋白功能具有重要作用，一方面糖基化可以促进蛋白质折叠，保证正确构象，另一方面，糖基化介导蛋白-蛋白相互作用，使蛋白质具有完整的生物学功能。在细胞水平上，糖基化影响细胞之间的识别，并且在肿瘤发生、浸润、转移的过程发挥重要作用。大量的研究结果表明，在疾病的发生发展过程中伴随着蛋白质糖基化的改变，并且这种疾病相关的异常糖基化能够反映疾病的发展进程。

随着医学技术的发展，寻求一种无损的检测方法是体外检测的发展趋势。唾液是人体的体液之一，近些年来，唾液作为临床样本已被广泛应用于多种疾病诸如艾滋病、自身免疫性疾病、酒精性肝硬变、囊性纤维病、糖尿病、心血管病、龋病等疾病的药物水平监测、病情监控和疗效评价当中。而基于唾液检测的新技术和新方法也会逐渐成为今后非侵袭性临床诊断发展的一个方向。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别糖尿病肾病/非糖尿病肾病的方案。

具体得出以下应用方案：

第一方面，特定凝集素构建基于唾液糖蛋白糖链鉴别糖尿病/非糖尿病肾病的测试工具的应用，所述特定凝集素分为上调组和下调组；其中：

上调组为npa、hhl、pha-e+l、ptl-ii中的至少一种；

下调组为mpl、sba、ltl、aal中的至少一种；

鉴别依据为：对于肾病患者的被测唾液样本，若所述上调组识别的糖蛋白糖链结构表达显著上调，所述下调组识别的糖蛋白糖链结构表达显著下调，则表明该肾病具体为糖尿病肾病(dn)；反之，则为非糖尿病肾病(ndrd)。

这里，所述测试工具给出“鉴别依据”的具体形式不限，例如：随附的产品说明书中记载上述条件；涉及到软件的，则还可由相应的算法体现该依据。

进一步地，所述测试工具为凝集素芯片、试剂盒或以凝集素检测结果为输入的智能终端。

对于凝集素芯片来说，实际工作中也可以利用更全面的凝集素芯片取样，但对于鉴别糖尿病/非糖尿病来说，只关注上述特定凝集素。凝集素芯片的制备和检测为现有常规方法，其步骤一般包括唾液采集、唾液蛋白处理和荧光标记、芯片检测及数据分析。

第二方面，一种基于唾液糖蛋白糖链用于鉴别糖尿病/非糖尿病肾病的试剂盒，所述试剂盒中配置有凝集素；所述凝集素即上述特定凝集素；试剂盒的使用说明书给出以下鉴别依据：对于肾病患者的被测唾液样本，若上调组识别的糖蛋白糖链结构表达显著上调，下调组识别的糖蛋白糖链结构表达显著下调，则表明该肾病具体为糖尿病肾病(dn)；反之，则为非糖尿病肾病(ndrd)。

试剂盒的使用说明书中还可直接给出上述特定凝集素在对照组的糖蛋白糖链表达水平。这里的对照组，可以取自确诊的非糖尿病肾病(ndrd)，也可以取自确诊的糖尿病肾病(dn)，或建立这两个对照组。

第三方面，一种智能终端，包括处理器和程序存储器，所述程序存储器存储的程序被处理器加载时实现以下步骤：

获取肾病患者被测唾液样本的凝集素测试结果，所述凝集素测试结果体现上述特定凝集素对应的糖蛋白糖链表达水平；

获取相应的对照组的糖蛋白糖链表达水平以及鉴别依据(可预先记录在智能终端，也可从外部获取，如通过联网获取等)；所述鉴别依据为：若上调组识别的糖蛋白糖链结构表达显著上调，下调组识别的糖蛋白糖链结构表达显著下调，则表明该肾病具体为糖尿病肾病(dn)；反之，则为非糖尿病肾病(ndrd)；

将被测唾液样本与对照组的糖蛋白糖链表达水平进行比较，根据所述鉴别依据输出鉴别结论。

相应的，一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，其特征在于：所述计算机程序被处理器加载时实现以上所列各个步骤。

第四方面，本申请还结合二元logistic逐步回归分析利用37种凝集素构建糖尿病肾病/非糖尿病肾病的诊断模型，最后通过roc曲线分析(receiveroperatingcharacteristiccurve)评估诊断模型的区分能力。

一种智能终端，包括处理器和程序存储器，所述程序存储器存储的程序被处理器加载时实现以下步骤：

获取肾病患者被测唾液样本的凝集素测试结果，所述凝集素测试结果体现凝集素wga和ltl对应的糖蛋白糖链的表达水平；

根据所述凝集素测试结果，计算以下模型的检测值；

将计算得到的检测值输出显示，并提示鉴别结论；若检测值≤0.443，则为糖尿病肾病(dn)；反之检测值＞0.443，则为非糖尿病肾病(ndrd)。

相应的，一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器加载时实现以上所列各个步骤。

以上所说的“提示/输出鉴别结论”，可以是直接输出是否属于糖尿病肾病(dn)或非糖尿病肾病(ndrd)的结论，也可以仅给出检测值、参考值和鉴别依据，或者二者兼有。

智能终端的具体形式可以是专门的自助终端设备，也可以是普通用户常用的手机、平板电脑等。

第五方面，一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别糖尿病/非糖尿病肾病的系统，包括：

a、用于获取唾液样本特定糖蛋白糖链结构的表达水平的设备，所述特定糖蛋白糖链结构分别由凝集素wga和ltl特异性识别；

b、上述一种智能终端(计算模型的检测值)。

该系统中，用于获取唾液样本特定糖蛋白糖链结构的表达水平的设备和用于基于唾液糖蛋白糖链鉴别糖尿病/非糖尿病肾病的智能终端可以是集成一体的医疗诊断综合设备，也可以是分立的设备，甚至没有任何信号连接(例如可以由医护人员、患者等自行取送唾液样本的凝集素测试结果)。

上述用于获取唾液样本特定糖蛋白糖链结构的表达水平的设备包括凝集素芯片、孵育盒和生物芯片扫描系统，其中凝集素芯片上至少设置有凝集素wga和ltl。

以上各方面的应用方案的具体操作可以相互借鉴、结合。

本申请具有如下有益效果：

本申请通过检测被试者唾液中特定糖蛋白糖链结构的表达水平差异，能够较为快速、准确地鉴别被试肾病患者具体类型属于糖尿病肾病，或是非糖尿病肾病。

附图说明

图1为38例唾液样本(糖尿病肾病dn，n＝19；非糖尿病肾病ndrd，n＝19)凝集素芯片分析结果中差异凝集素结果的散点图分析。图中，纵坐标表示凝集素芯片上该凝集素所对应的归一化荧光强度nfi，图中横线代表两端所示两组间的比较，p为根据单因素方差分析所获得的p-value，其中*,p<0.05，表示差异显著；**,p<0.01，表示差异非常显著；***,p<0.001，表示差异极显著；dn：糖尿病肾病患者，ndrd：非糖尿病肾病患者。

图2为凝集素芯片筛选出的8种差异凝集素roc曲线分析结果；auc为线下面积。

图3为基于凝集素芯片结果构建的dn/ndrd鉴别模型，通过roc曲线分析评估其诊断能力。

具体实施方式

以下介绍本申请的相关实验及结论，以揭示本申请技术方案的科学性和可行性。应当理解，申请人为此所进行的研发过程及付出的人力物力不止于此。

一、糖尿病肾病和非糖尿病肾病患者唾液蛋白质差异糖链结构的筛选

研究方法：

1.1、唾液样本的收集及预处理

本实验所采用的糖尿病肾病(dn)和非糖尿病肾病(ndrd)患者的唾液样本均严格经过解放军总医院的伦理审批(humanresearchethicscommittees(hrecs))。所有捐赠唾液样本的志愿者连同协助采样指导的临床医师均对本研究工作知情、同意且高度配合，在均一的采样要求之下完成唾液样本的采集。其具体要求为：样本捐献者除肾病外其他的器官应无炎症以及肿瘤等慢性疾病，在采样时捐献者需确定在采集唾液前3小时内未进食并且24小时内未服用药物，然后用洁净无菌的生理盐水(0.9％nacl)漱口三次，确保捐献者口腔卫生和无食物残渣的前提下，捐献者舌尖抵住上颚并于舌下收集自然分泌的唾液样本收集至2ml离心管，立即加入10μl蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitorcocktail，sigma-aldrich,u.s.a)于冰浴暂存。在临床医师指导下共收集唾液样本38例：其中糖尿病肾病患者19例(dn，n＝19)，非糖尿病肾病患者19例(ndrd，n＝19)，具体的样本信息如表1所示。

唾液采集12小时内，将唾液按1ml分装至离心管中，若有量少不足1ml者可加入1×pbs补足至1ml，10,000g×15min离心，小心吸取上清液，经微量核酸蛋白测定仪(nano-drop)测定浓度后按1mg唾液蛋白:10μl蛋白酶抑制剂的量加入蛋白酶抑制剂，混匀后分装于-80℃贮藏。

表1用于区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病凝集素芯片及诊断模型构建唾液样本信息

1.2、患者唾液蛋白的荧光标记与定量

使用nanophotometer测定唾液样本蛋白浓度，取100μg唾液蛋白与等体积地的0.1mol/lna2co3/nahco3ph9.3缓冲液混合，加入5μl荧光溶液于室温避光孵育3小时，期间样本严格避光且保持震荡。反应结束后，向样本中加入5μl4m羟胺溶液，于冰上反应15分钟。利用sephadexg-25脱盐柱柱分离荧光标记蛋白。用新1.5ml离心管收集荧光样本并进行定量，荧光标记后的样本避光防止荧光基团猝灭，于-20℃贮藏。

1.3、凝集素芯片比较分析糖尿病肾病与非糖尿病肾病患者唾液糖蛋白糖链谱

本申请采用的是一款由37种凝集素构成的凝集素芯片，其可识别并结合常见的n-糖链与o-糖链结构。芯片的具体制备过程详见yannanqin等的报道。

取出芯片，置于37℃真空干燥器真空干燥30min，随后放入1×pbst中清洗5min×2次，再使用1×pbs清洗5min×2次。清洗完成后用小型载玻片离心机甩干。随后向芯片的每个点样区加入120μl凝集素芯片封闭液，将芯片置于孵育盒密封后于恒温孵育箱内37℃反应1h，以封闭芯片表面的活性基团降低荧光扫描时玻片背底的信号值。封闭完成后，使用1×pbst清洗5min×2次，1×pbs清洗5min×2次，甩干后向芯片的每个点样区加入荧光标记的唾液蛋白与1.5×孵育缓冲液混合，于37℃恒温孵育3h，待反应结束后使用1×pbst清洗5min×2次，1×pbs清洗5min×2次，甩干后使用激光共聚焦芯片扫描仪读取数据。扫描参数设定为：激发波长532nm，pmt功率70％，激发强度为100％。

1.4、凝集素芯片数据分析

凝集素芯片荧光信号的数值化过程通过genepixpro(4000b)软件完成，通过对每个阵列的数据提取，获得的数据包括：探针信号减去背景信号所获得的净差值fi(fluorescentintensity)、背景的标准方差sd(standarddeviation)等数据。在分析过程中，首先根据各个点的fi/sd判断该点数据的有效性，取fi/sd≥1.5的点作为有效数据，计算各个探针标准归一化荧光信号值nfi(normalizedfluorescentintensity)，即用各个探针的medianfi值除以37个检测探针fi值之和，用算式表示为：nfix＝medianfix/(medianfi1+medianfi2+medianfi3+…+medianfi37)，据此可获得每个阵列上37种凝集素探针所对应的nfi并用作统计学分析。

这里的统计学分析主要是利用graphpadprism6.0对dn和ndrd组数据进行比值分析，结合t检验筛选具有nfi显著性差异的凝集素(两组间任一凝集素比值大于1.50或小于0.67，且p小于0.05)。

研究结果：

2.1凝集素芯片比较分析dn和ndrd患者唾液糖蛋白糖链

利用凝集素芯片比较分析19例dn患者，19例ndrd患者唾液样本糖蛋白糖链谱。比较结果如图1所示，一系列统计学数据可在图上直观地反应出各组间比较的差异显著性及离散程度。根据各组间差异分析的结果来看：相比唾液中其他糖蛋白糖链结构，可特异性识别high-mannose,manα1-6man的凝集素npa，hhl，识别bisectingglcnac,bi-antennaryn-glycans,tri-andtetra-antennarycomplex-typen-glycan的凝集素pha-e+l，识别gal,bloodgrouph,t-antigen的凝集素ptl-ii在dn患者的结合强度明显高于ndrd患者。而识别galβ1-3galnac,galnac的凝集素mpl，识别α-orβ-linkedterminalgalnac,(galnac)n,galnacα1-3gal,blood-groupa的凝集素sba，识别fucα1-3galβ1-4glcnac的凝集素ltl以及识别fucα1-3/6glcnac的凝集素aal在dn患者的结合强度明显低于ndrd患者。

由此，可以得出以下临床应用：对于未知具体类型的肾病患者，通过检测其唾液糖蛋白糖链结构，若凝集素npa、hhl、pha-e+l、ptl-ii特异识别的糖蛋白糖链结构表达显著上调，凝集素mpl、sba、ltl、aal特异识别的糖蛋白糖链结构表达显著下调，则表明该肾病具体为糖尿病肾病(dn)；反之，则为非糖尿病肾病(ndrd)。

二、利用37种凝集素构建dn诊断模型

以下通过分析唾液糖蛋白糖链谱结合凝集素的芯片数据实现对dn和ndrd患者的准确区分。首先对上述存在显著差异的8种凝集素进行roc曲线分析，以估测其对样本的诊断鉴别能力。通常情况下，roc曲线的线下面积(auc)达到0.80时才认为该方法有一定的鉴别能力。分别以上述8种凝集素为指标区分dn与ndrd患者，roc分析结果如图2所示，凝集素npa的auc为0.831，特异性为73.68％，灵敏度为84.21％，而其余7种凝集素的auc均未达到0.8。说明单一凝集素用于区分dn和ndrd患者方面存在一定的不足。

另外，还注意到：识别multivalentsiaand(glcnac)n的凝集素wga在dn与ndrd组之间的比值(dn/ndrd)为1.46，虽然未达到1.5以上，但是统计学分析结果显示两组数据具有明显的统计学差异(p<0.01)。

本申请借鉴二元逐步logistic回归方法结合37种凝集素构建诊断模型以提高鉴别能力。

使用spss软件结合dn与ndrd患者唾液蛋白凝集素芯片数据利用二元逐步logistic回归方法构建dn/ndrd鉴别模型，用于区分dn与ndrd患者。最终优化得到的模型公式如下：

modeldn/ndrd的auc为0.9，cut-off值为0.443(检测值≤0.443为dn患者，反之检测值＞0.443,则为ndrd患者)灵敏度为94.74％，特异性为89.47％；能够准确鉴别出19例dn患者中的17例，19例ndrd中的18例，其roc曲线如图3所示。

上述模型只涉及两种凝集素，能够更为简便、低成本、准确地鉴别糖尿病/非糖尿病肾病。