一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法与流程

本发明属于烟草化学成分分析的
技术领域：
，涉及一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法，具体涉及一种烟草及烟草制品中有机酸类物质包括挥发性有机酸、非挥发性有机酸及高级脂肪酸的丙酯化分析方法。
背景技术：
：烟草中的有机酸类物质是影响烟草感官评价的重要指标，也是烟草中一类重要的致香成分。有机酸类物质包括挥发性有机酸、非挥发性有机酸和高级脂肪酸，其中挥发性有机酸，如异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、3-甲基戊酸等小分子酸，由于沸点低易挥发，可以直接进入到烟气中，丰富卷烟香气风格，对烟草的抽吸感官评价有着直接影响；另外非挥发性有机酸和高级脂肪酸也是重要的致香成分，可以起到调节烟叶酸碱平衡、平衡烟气的作用，使吸味醇和。因此，准确定量检测烟草中的有机酸类物质对烟叶品质评价具有重要意义。目前，对挥发性有机酸、非挥发性有机酸及高级脂肪酸的定量检测是分开进行的。挥发性有机酸的检测已有行业标准《yc/t500-2014烟草及烟草制品挥发性有机酸的测定气相色谱-质谱联用法》，该法能对烟草及烟草制品中的挥发性有机酸进行准确定量检测。烟草及烟草制品中非挥发性有机酸的检测已有行业标准《yc/t288-2009烟草及烟草制品多元酸(草酸、苹果酸和柠檬酸)的测定气相色谱法》，该法采用硫酸-甲醇的甲酯化法检测游离态和结合态多元酸，但对于挥发性有机酸而言，因其分子量小，甲酯化后生成的有机酸甲酯沸点过低而在程序升温初始阶段随溶剂流出，难以分析。烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测，可采用行业内常用的高级脂肪酸甲酯化法，其能够降低非待测物沸点，提高分离度；也可采用已有行业标准《gb5009.168—2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》进行检测；更可采用乙酰氯-甲醇的甲酯化法进行测定。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法，用于解决现有技术中缺乏同时对有机酸类物质中挥发性有机酸、非挥发性有机酸及高级脂肪酸物质进行分析的方法的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法，包括以下步骤：1)将烟草或烟草制品加入硫酸-正丙醇溶液进行丙酯衍生化后振荡提取，获得样品溶液；2)分别将多种有机酸类物质的标样，加入溶剂稀释定容，获得混合标准溶液；3)分别将步骤1)获得的样品溶液与步骤2)获得的混合标准溶液进行气相色谱质谱法(gc-ms)测定，比较保留时间定性，确定样品溶液中多种有机酸类物质，再通过内标标准曲线法计算样品溶液中多种有机酸类物质的含量。上述烟草(学名：nicotianatabacuml.)是茄科烟草属植物，为烟草工业的原料。上述烟草制品为烟草的制成品，包括且不限于卷烟、口含烟、电子烟等。上述有机酸类物质选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、巴豆酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸、草酸、庚酸、乳酸、丙二酸、苯甲酸、辛酸、苯乙酸、壬酸、苹果酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、α-亚麻酸、硬脂酸中的一种或多种。其中，挥发性有机酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、巴豆酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸、庚酸、苯甲酸、辛酸、苯乙酸、壬酸、癸酸中的一种或多种。非挥发性有机酸选自草酸、乳酸、丙二酸、苹果酸中的一种或多种。高级脂肪酸选自月桂酸、肉豆蔻酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、α-亚麻酸、硬脂酸中的一种或多种。较佳地，步骤1)中，所述丙酯衍生化是在烟草或烟草制品中分别加入第一内标工作溶液(is-1)和第二内标工作溶液(is-2)后，再加入硫酸-正丙醇溶液，涡旋振荡后进行水浴加热，取出，静置冷却至室温。优选地，所述第一内标工作溶液(is-1)为浓度为0.3-0.8mg/ml的反式-3-己烯酸的正丙醇溶液。更优选地，所述第一内标工作溶液(is-1)为浓度为0.5mg/ml的反式-3-己烯酸的正丙醇溶液。优选地，所述第二内标工作溶液(is-2)为浓度为9-11mg/ml的己二酸的正丙醇溶液。更优选地，所述第二内标工作溶液(is-2)为浓度为10mg/ml的己二酸的正丙醇溶液。上述第一内标工作溶液和第二内标工作溶液置于4℃的冰箱中避光保存，第一内标工作溶液和第二内标工作溶液的保存期限为6个月。优选地，所述烟草或烟草制品加入的质量与第一内标工作溶液加入的体积、第二内标工作溶液加入的体积之比为0.095-0.105:50:100，g/μl/μl。更优选地，所述烟草或烟草制品加入的质量与第一内标工作溶液加入的体积、第二内标工作溶液加入的体积之比为0.1:50:100，g/μl/μl。优选地，所述烟草或烟草制品加入的质量与硫酸-正丙醇溶液加入的体积之比为0.1:0.5-1.5，g/ml。更优选地，所述烟草或烟草制品加入的质量与硫酸-正丙醇溶液加入的体积之比为0.1:1，g/ml。优选地，所述硫酸-正丙醇溶液是体积百分比为9-11％的硫酸与正丙醇的混合水溶液，所述硫酸与正丙醇的体积之比为1:8-10。更优选地，所述硫酸-正丙醇溶液是体积百分比为10％的硫酸与正丙醇的混合水溶液，所述硫酸与正丙醇的体积之比为1:9。优选地，所述涡旋振荡的时间为1-3min。更优选地，所述涡旋振荡的时间为2min。优选地，所述涡旋振荡的振荡频率为2000-3000rpm。优选地，所述水浴加热的时间为2.5-3.5h，所述水浴加热的温度为65-75℃。更优选地，所述水浴加热的时间为3h，所述水浴加热的温度为70℃。优选地，所述室温为20-30℃。较佳地，步骤1)中，所述振荡提取是将丙酯衍生化处理后的烟草或烟草制品，加入水和正己烷后进行涡旋振荡，取出，静置分层，取上层清液，即得所需的样品溶液。优选地，所述烟草或烟草制品加入的质量与水加入的体积、正己烷加入的体积之比为0.1:4-6:1-3，g/ml/ml。更优选地，所述烟草或烟草制品加入的质量与水加入的体积、正己烷加入的体积之比为0.1:5:2，g/ml/ml。优选地，所述涡旋振荡的时间为0.5-1.5min。更优选地，所述涡旋振荡的时间为1min。优选地，所述涡旋振荡的振荡频率为2000-3000rpm。较佳地，步骤2)中，所述溶剂为正丙醇。较佳地，步骤2)中，所述混合标准溶液中多种有机酸类物质的浓度范围为0.122μg/g-11.25mg/g。较佳地，步骤2)中，所述混合标准溶液中还加入第一内标工作溶液(is-1)和第二内标工作溶液(is-2)，所述混合标准溶液中加入的第一内标工作溶液(is-1)为25-75μl，加入的第二内标工作溶液(is-2)为75-125μl。优选地，所述混合标准溶液中加入的第一内标工作溶液(is-1)为50μl，加入的第二内标工作溶液(is-2)为100μl。优选地，所述第一内标工作溶液(is-1)为浓度为0.3-0.8mg/ml的反式-3-己烯酸的正丙醇溶液。更优选地，所述第一内标工作溶液(is-1)为浓度为0.5mg/ml的反式-3-己烯酸的正丙醇溶液。优选地，所述第二内标工作溶液(is-2)为浓度为9-11mg/ml的己二酸的正丙醇溶液。更优选地，所述第二内标工作溶液(is-2)为浓度为10mg/ml的己二酸的正丙醇溶液。较佳地，步骤3)中，所述气相色谱质谱法中，所述气相色谱选用的色谱柱为db-fatwax毛细管色谱柱[30m(长度)×0.25mm(内径)×0.25μm(膜厚)]。较佳地，步骤3)中，所述气相色谱质谱法中，所述气相色谱的升温程序为：初始温度40℃保持2min，以15℃/min的速率升至220℃保持15min。较佳地，步骤3)中，所述气相色谱质谱法中，所述气相色谱的进样条件为：进样口温度：250℃；进样量：2μl；分流模式：分流进样；载气：高纯氦气(he)，载气纯度≥99.999％；载气流量：2.0ml/min；恒流模式。较佳地，步骤3)中，所述气相色谱质谱法中，所述质谱的测定条件为：电离方式：电子轰击(ei)离子源；电离能量：70ev；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；辅助接口温度：220℃；溶剂延迟：2min；扫描方式：全扫描(scan)和选择离子监测(sim)；全扫描方式的扫描范围：29-300amu。优选地，所述质谱测定中选择的定量离子分别为：甲酸42、乙酸73、丙酸75、丁酸89、异丁酸89、巴豆酸69、戊酸103、异戊酸103、2-甲基丁酸85、3-甲基戊酸117、己酸117、草酸133、庚酸113、乳酸75、丙二酸105、苯甲酸123、辛酸145、苯乙酸178、壬酸159、苹果酸117、癸酸173、月桂酸183、肉豆蔻酸211、柠檬酸261、棕榈酸239、亚油酸263、油酸265、α-亚麻酸320、硬脂酸285。较佳地，步骤3)中，所述内标标准曲线法包括以下步骤：a)制备一系列不同浓度的步骤2)中的混合标准溶液，分别进行gc-ms检测，获得多种有机酸类物质/内标的色谱峰面积比与相应有机酸类物质/内标的浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到多种有机酸类物质的标准工作曲线的回归方程；b)将步骤1)中样品溶液进行gc-ms检测，将获得的多种有机酸类物质与内标的色谱峰面积比，代入步骤a)中多种有机酸类物质的标准工作曲线的回归方程，并根据内标物的已知浓度，计算得到样品溶液中多种有机酸类物质的浓度。优选地，所述标准工作曲线中，以多种有机酸类物质与内标的色谱峰面积比为纵坐标(y轴)，其相应有机酸类物质与内标的浓度比为横坐标(x轴)。较佳地，步骤3)中，所述内标标准曲线法中，所述有机酸类物质用于定量的对应内标分别为：甲酸is-1、乙酸is-1、丙酸is-1、丁酸is-1、异丁酸is-1、巴豆酸is-1、戊酸is-1、异戊酸is-1、2-甲基丁酸is-1、3-甲基戊酸is-1、己酸is-1、草酸is-2、庚酸is-1、乳酸is-2、丙二酸is-2、苯甲酸is-1、辛酸is-1、苯乙酸is-1、壬酸is-1、苹果酸is-2、癸酸is-1、月桂酸is-2、肉豆蔻酸is-2、柠檬酸is-2、棕榈酸is-2、亚油酸is-2、油酸is-2、α-亚麻酸is-2、硬脂酸is-2。如上所述，本发明提供的一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法，具有以下有益效果：(1)本发明提供的一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法，针对现有挥发性有机酸、非挥发性有机酸及高级脂肪酸的测定独立分开进行的现状，能够同时对烟草及烟草制品中挥发性有机酸、非挥发性有机酸及高级脂肪酸进行定量检测，将原有的三种检测方法缩减为一种，节省前处理流程，缩短前处理步骤，使方法更加高效、便捷。(2)本发明提供的一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法，在硫酸-甲醇甲酯化法的基础上，开发出硫酸-正丙醇的丙酯化方法，将烟草及烟草制品中的挥发性有机酸、非挥发性有机酸及高级脂肪酸衍生为有机酸丙酯，进而进行气相色谱-质谱定量检测，节省前处理流程，缩短前处理步骤，使方法更加高效、便捷。(3)本发明提供的一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法，其针对多种有机酸类物质，精密度高、重复性好、回收率优。附图说明图1显示为本发明的一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法的总离子流图，其中，图1a为保留时间为1-10分钟的总离子流图，图1b为保留时间为10-22分钟的总离子流图。图中，各附图标记分别为：1：甲酸，2：乙酸，3：丙酸，4：异丁酸，5：丁酸，6：异戊酸，7：2-甲基丁酸，8：戊酸，9：巴豆酸，10：3-甲基戊酸，11：己酸，12：反式-3-己烯酸(is1)，13：庚酸，14：乳酸，15：辛酸，16：草酸，17：壬酸，18：癸酸，19：丙二酸，20：苯甲酸，21：苯乙酸，22：月桂酸，23：己二酸(is2)，24：肉豆蔻酸，25：苹果酸，26：棕榈酸，27：硬脂酸，28：油酸，29：亚油酸，30：α-亚麻酸，31：柠檬酸。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。以下实施例使用的材料、试剂和仪器如下：1、材料与试剂甲酸(98％，j&k)、乙酸(99.5％，j&k)、丙酸(99.0％，drehrenstorfergmbh)、异丁酸(99.0％，drehrenstorfergmbh)、丁酸(99.0％，tci)、巴豆酸(98％，j&k)、异戊酸(99.0％，drehrenstorfergmbh)、戊酸(98.0％，tci)、2-甲基丁酸(95％，喜登香料)、3-甲基戊酸(99.0％，cnw)、己酸(98.0％，tci)、乳酸(99.0％，cnw)、草酸(98.8％，drehrenstorfergmbh)、庚酸(98.0％，tci)、丙二酸(97.0％，cnw)、辛酸(99.2％，drehrenstorfergmbh)、苯甲酸(99.5％，sigma-aldrich)、苯乙酸(95％，喜登香精)、壬酸(97.0％，drehrenstorfergmbh)、苹果酸(99.0％，cnw)、癸酸(98.7％，drehrenstorfergmbh)、月桂酸(98.0％，cnw)、肉豆蔻酸(99.0％，cnw)、柠檬酸(98.0％，cnw)、棕榈酸(97.0％，cnw)、亚油酸(99.0％，cnw)、油酸(98.0％，cnw)、α-亚麻酸(98.5％，cnw)、硬脂酸(95.0％，cnw)；反式-3-己烯酸(95.0％，cnw)；己二酸(99.0％，cnw)；正丙醇(≥99.0％，上海凌峰化学试剂有限公司)；硫酸(浓度≥98wt％，国药试剂)；正己烷(95％，j&k)；去离子水(millipore纯水机自制)。2、仪器7890b气相色谱-5977a质谱联用仪(agilent)；db-fatwax毛细管柱(agilent)；vortex-genie2型涡旋振荡仪(scientificindustries)；hh-s11-25型水浴(上海贺德实验设备有限公司)。本发明的一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法的分析过程如下1、样品前处理准确称取烟草或烟草制品的样品，分别加入第一内标工作溶液(is-1)和第二内标工作溶液(is-2)后，再加入硫酸-正丙醇溶液进行丙酯衍生化处理，即迅速密封后在2000-3000rpm频率下进行涡旋振荡1-3min，再在65-75℃水浴锅中加热2.5-3.5h，取出，静置冷却至室温。其中，第一内标工作溶液(is-1)为浓度为0.3-0.8mg/ml的反式-3-己烯酸的正丙醇溶液；第二内标工作溶液(is-2)为浓度为9-11mg/ml的己二酸的正丙醇溶液；硫酸-正丙醇溶液是体积百分比为9-11％的硫酸与正丙醇的混合水溶液，硫酸与正丙醇的体积之比为1:8-10。烟草或烟草制品加入的质量与第一内标工作溶液加入的体积、第二内标工作溶液加入的体积之比为0.095-0.105:50:100，g/μl/μl。烟草或烟草制品加入的质量与硫酸-正丙醇溶液加入的体积之比为0.1:0.5-1.5，g/ml。然后，将丙酯衍生化处理后的烟草或烟草制品进行振荡提取，即加入水和正己烷在2000-3000rpm频率下进行涡旋振荡0.5-1.5min，取出，静置分层，取上层清液，即得所需的样品溶液。其中，烟草或烟草制品加入的质量与水加入的体积、正己烷加入的体积之比为0.1:4-6:1-3，g/ml/ml。2、配制标准溶液将多种有机酸类物质的标样，加入正丙醇稀释定容，获得混合标准溶液。混合标准溶液中，有机酸类物质共29种，包括有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、巴豆酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸、草酸、庚酸、乳酸、丙二酸、苯甲酸、辛酸、苯乙酸、壬酸、苹果酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、α-亚麻酸、硬脂酸。其中，挥发性有机酸包括有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、巴豆酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸、庚酸、苯甲酸、辛酸、苯乙酸、壬酸、癸酸。非挥发性有机酸包括有草酸、乳酸、丙二酸、苹果酸。高级脂肪酸包括有月桂酸、肉豆蔻酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、α-亚麻酸、硬脂酸。混合标准溶液中多种有机酸类物质的浓度范围为0.122μg/g-11.25mg/g。混合标准溶液还加入第一内标工作溶液(is-1)和第二内标工作溶液(is-2)，混合标准溶液中加入的第一内标工作溶液(is-1)为25-75μl，加入的第二内标工作溶液(is-2)为75-125μl。。第一内标工作溶液(is-1)为浓度为0.3-0.8mg/ml的反式-3-己烯酸的正丙醇溶液。第二内标工作溶液(is-2)为浓度为9-11mg/ml的己二酸的正丙醇溶液。3、测定分别将样品溶液与混合标准溶液进行气相色谱质谱法(gc-ms)测定，比较保留时间定性，确定样品溶液中多种有机酸类物质，再通过内标标准曲线法计算样品溶液中多种有机酸类物质的含量。具体来说，先制备一系列不同浓度的混合标准溶液，分别进行gc-ms检测，获得多种有机酸类物质/内标的色谱峰面积比与相应有机酸类物质/内标的浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到多种有机酸类物质的标准工作曲线的回归方程。再将样品溶液进行gc-ms检测，将获得的多种有机酸类物质与内标的色谱峰面积比，代入多种有机酸类物质的标准工作曲线的回归方程，并根据内标物的已知浓度，计算得到样品溶液中多种有机酸类物质的浓度。其中，气相色谱的测定条件为：色谱柱：为db-fatwax毛细管色谱柱[30m(长度)×0.25mm(内径)×0.25μm(膜厚)]；进样口温度：250℃；进样量：2μl；分流模式：分流进样；载气：高纯氦气(he)，载气纯度≥99.999％；载气流量：2.0ml/min；恒流模式；升温程序为：初始温度40℃保持2min，以15℃/min的速率升至220℃保持15min。质谱的测定条件为：电子轰击(ei)离子源；电离能量：70ev；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；辅助接口温度：220℃；溶剂延迟：2min；扫描方式：全扫描(scan)和选择离子监测(sim)；全扫描方式的扫描范围：29-300amu。质谱测定中选择的定量离子分别为：甲酸42、乙酸73、丙酸75、丁酸89、异丁酸89、巴豆酸69、戊酸103、异戊酸103、2-甲基丁酸85、3-甲基戊酸117、己酸117、草酸133、庚酸113、乳酸75、丙二酸105、苯甲酸123、辛酸145、苯乙酸178、壬酸159、苹果酸117、癸酸173、月桂酸183、肉豆蔻酸211、柠檬酸261、棕榈酸239、亚油酸263、油酸265、α-亚麻酸320、硬脂酸285。有机酸类物质用于定量的对应内标分别为：甲酸is-1、乙酸is-1、丙酸is-1、丁酸is-1、异丁酸is-1、巴豆酸is-1、戊酸is-1、异戊酸is-1、2-甲基丁酸is-1、3-甲基戊酸is-1、己酸is-1、草酸is-2、庚酸is-1、乳酸is-2、丙二酸is-2、苯甲酸is-1、辛酸is-1、苯乙酸is-1、壬酸is-1、苹果酸is-2、癸酸is-1、月桂酸is-2、肉豆蔻酸is-2、柠檬酸is-2、棕榈酸is-2、亚油酸is-2、油酸is-2、α-亚麻酸is-2、硬脂酸is-2。实施例11、样品前处理准确称取0.1g(精确至0.1mg)烟草或烟草制品的样品于15ml厚壁离心管中，分别加入50μl浓度为0.5mg/ml第一内标工作溶液(is-1)：反式-3-己烯酸的正丙醇溶液和100μl浓度为10mg/ml的第二内标工作溶液(is-2)：己二酸的正丙醇溶液后，再加入1ml10％硫酸-正丙醇溶液进行丙酯衍生化处理，即迅速密封瓶口，在2500rpm频率下进行涡旋振荡2min，再在70℃水浴锅中加热3h，取出，静置冷却至室温。其中，硫酸-正丙醇溶液中，硫酸与正丙醇的体积之比为1:9。硫酸-正丙醇溶液是在冰浴搅拌条件下，缓慢将浓硫酸通过玻璃棒引流加入正丙醇溶液，配成。然后，将丙酯衍生化处理后的烟草或烟草制品的样品在2500rpm频率下进行振荡提取，即加入5ml去离子水、2ml正己烷，进行涡旋振荡1.0min，取出，静置分层，取上层清液，即得所需的样品溶液1#。2、配制标准溶液将多种有机酸类物质的标样，加入正丙醇稀释定容，获得混合标准溶液。混合标准溶液中，有机酸类物质共29种，包括有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、巴豆酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸、草酸、庚酸、乳酸、丙二酸、苯甲酸、辛酸、苯乙酸、壬酸、苹果酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、α-亚麻酸、硬脂酸。其中，挥发性有机酸包括有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、巴豆酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸、庚酸、苯甲酸、辛酸、苯乙酸、壬酸、癸酸。非挥发性有机酸包括有草酸、乳酸、丙二酸、苹果酸。高级脂肪酸包括有月桂酸、肉豆蔻酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、α-亚麻酸、硬脂酸。混合标准溶液中29种有机酸类物质的浓度范围为0.122μg/g-11.25mg/g。。混合标准溶液还加入50μl第一内标工作溶液(is-1)和100μl第二内标工作溶液(is-2)。第一内标工作溶液(is-1)为浓度为0.5mg/ml的反式-3-己烯酸的正丙醇溶液。第二内标工作溶液(is-2)为浓度为10mg/ml的己二酸的正丙醇溶液。3、测定分别将样品溶液1#与混合标准溶液进行气相色谱质谱法(gc-ms)测定，比较保留时间定性，确定样品溶液1#中29种有机酸类物质，再通过内标标准曲线法计算样品溶液1#中29种有机酸类物质的含量。具体来说，先制备一系列不同浓度的混合标准溶液，分别进行gc-ms检测，获得29种有机酸类物质/内标的色谱峰面积比与相应有机酸类物质/内标的浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到29种有机酸类物质的标准工作曲线的回归方程。再将样品溶液1#进行gc-ms检测，将获得的29种有机酸类物质与内标的色谱峰面积比，代入29种有机酸类物质的标准工作曲线的回归方程，并根据内标物的已知浓度，计算得到样品溶液1#中29种有机酸类物质的浓度。其中，气相色谱的测定条件为：色谱柱：为db-fatwax毛细管色谱柱[30m(长度)×0.25mm(内径)×0.25μm(膜厚)]；进样口温度：250℃；进样量：2μl；分流模式：分流进样；载气：高纯氦气(he)，载气纯度≥99.999％；载气流量：2.0ml/min；恒流模式；升温程序为：初始温度40℃保持2min，以15℃/min的速率升至220℃保持15min。质谱的测定条件为：电子轰击(ei)离子源；电离能量：70ev；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；辅助接口温度：220℃；溶剂延迟：2min；扫描方式：全扫描(scan)和选择离子监测(sim)；全扫描方式的扫描范围：29-300amu。样品溶液1#中29种有机酸类物质的保留时间、定量选择离子和内标选择见表1。样品溶液1#中29种有机酸类物质和内标的色谱图见图1a、图1b。表1物质名称保留时间(min)定量离子内标1甲酸2.97442is-12乙酸3.57373is-13丙酸4.42575is-14异丁酸4.51089is-15丁酸5.32389is-16异戊酸5.516103is-172-甲基丁酸5.69285is-18戊酸6.415103is-19巴豆酸6.75287is-1103-甲基戊酸6.872117is-111己酸7.425117is-112反式-3-己烯酸(is-1)8.09511413庚酸8.376113is-114乳酸8.44575is-215辛酸9.277145is-116草酸10.058133is-217壬酸10.128159is-118癸酸10.933173is-119丙二酸11.028105is-220苯甲酸11.283123is-121苯乙酸12.065178is-122月桂酸12.436183is-223己二酸(is-2)13.44717124肉豆蔻酸13.807211is-225苹果酸14.263117is-226棕榈酸15.243239is-227硬脂酸17.307285is-228油酸17.613265is-229亚油酸18.288263is-230α-亚麻酸18.733320is-231柠檬酸19.407261is-2实施例2分别取0.01ml、0.02ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml的29种有机酸类物质的标样，再加入50μl第一内标工作溶液(is-1)和100μl第二内标工作溶液(is-2)，加入正丙醇稀释定容，配成29种有机酸类物质的9级不同浓度的混合标准溶液。同时，配制29种有机酸类物质的浓度为0μg/l的溶液表示溶剂空白。混合标准溶液中，29种有机酸类物质的浓度范围分别为：甲酸：70.88～10631.4μg/g，乙酸：63.76～9564.0μg/g，丙酸：0.794～63.520μg/g，异丁酸：0.381～57.168μg/g，丁酸：0.973～29.196μg/g，异戊酸：1.182～177.252μg/g，2-甲基丁酸：10.616～1592.4μg/g，戊酸：0.193～28.92μg/g，巴豆酸：0.786～117.88μg/g，3-甲基戊酸：0.400～59.940μg/g，己酸：0.144～21.528μg/g，庚酸：0.122～18.270μg/g，辛酸：0.143～14.328μg/g，壬酸：0.138～20.640μg/g，癸酸：0.151～15.144μg/g，乳酸：0.062～4.620mg/g，苯甲酸：0.766～114.906μg/g，苯乙酸：1.038～103.796μg/g，草酸：0.131～19.695mg/g，丙二酸：0.050～4.999mg/g，月桂酸：0.052～7.854mg/g，肉豆蔻酸：0.047～7.095mg/g，苹果酸：0.750～112.5mg/g，棕榈酸：0.131～19.590mg/g，硬脂酸：0.047～4.655mg/g，油酸：0.048～7.125mg/g，亚油酸：0.041～6.180mg/g，α-亚麻酸：0.050～3.750mg/g，柠檬酸：0.541～40.605mg/g。将上述配制好的9级不同浓度的混合标准溶液如上述实施例1中3所示，分别进行气相色谱质谱法分析，以29种有机酸类物质与内标的色谱峰面积比为纵坐标(y轴)，其相应有机酸类物质与内标的浓度比为横坐标(x轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数。具体结果见表2。由表2可知，回归方程的线性关系良好，相关系数r2>0.995。同时，对混合标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样10次，取其浓度测定值3倍标准差为检出限，10倍标准差为定量限。具体结果见表2。由表2可知，29种有机酸类物质的检出限分别为0.0142～20.4μg/g，定量限分别为0.0426～68.0μg/g，该方法具有较高的灵敏度。表2y：峰面积；x：浓度实施例3同一天内，对已知浓度的烟草或烟草制品的样品进行平行实验5次，考察方法的日内重复性。同时，在低、中、高三个浓度水平，进行样品加标回收率的测定，其结果见表3。由表3可知，在0.122μg/g-112.5mg/g的浓度范围内，相对标准偏差(rsd％)＜10％，方法重复性和回收率均良好。表3实验方法学考察数据实施例4应用本发明所建立的方法对不同的烤烟样品进行了检测，具体结果如下表4所示。由表4可知，该方法能够准确定量测定烤烟样品中29种有机酸类物质的含量。表4综上所述，本发明提供的一种烟草及烟草制品中有机酸类物质的丙酯化分析方法，能够同时对烟草及烟草制品中挥发性有机酸、非挥发性有机酸及高级脂肪酸进行定量检测，精密度高、重复性好、回收率优。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页12