一种基于荧光免疫层析技术的细小病毒检测试纸和方法与流程

本发明涉及生物免疫检测领域，涵盖了纳米材料技术、免疫学技术及侧流层析技术，更具体的说，本发明涉及一种基于荧光免疫层析技术的细小病毒检测试纸和方法。

背景技术：

感染细小病毒可使犬/猫精神沉郁、厌食、发热、软便或轻微呕吐，随后发展成为频繁呕吐和剧烈腹泻，传染率和死亡率均很高，所以如果犬/猫感染了细小病毒，需要尽早检测并及早治疗。

目前检测细小病毒的传统方法是胶体金免疫层析法，但是胶体金免疫层析灵敏度较低，稳定性也不够好，容易出现假阴假阳的现象。所以，开发出一种快速、灵敏、准确的检测方法是非常重要的。

技术实现要素：

本发明目的是针对现有技术存在的缺陷提供一种基于荧光免疫层析技术的细小病毒检测试纸及检测方法；在检测细小病毒的试纸条中用含nacl的溶液处理标记物垫，可有效的消除假阳性的问题，提高产品的稳定性。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

一种基于荧光免疫层析技术的检测试纸，包括pvc底板及粘贴在pvc底板上表面的样品垫、标记物垫、捕获膜、吸水垫，相邻的每一部分均在边接处交叠边接，所述捕获膜上含有c线和t线；所述标记物垫含有0.1％-10％的nacl浸泡液、荧光微球标记的细小病毒检测抗体及生物素标记的细小病毒捕获抗体或者含有荧光微球标记的对照蛋白或抗体；所述t线含有捕获探针；所述c线含有能结合细小病毒检测抗体的二抗或者含有可做阳性对照的抗体。

优选的，所述样品垫为玻璃纤维、滤纸或滤血膜中的一种；所述标记物垫为玻璃纤维、滤纸或聚酯膜中的一种；其中，样品垫和标记物垫材质相同时可整合在一起。

优选的，所述捕获探针为结合在捕获膜上的细小病毒捕获抗体或者蛋白。

优选的，所述捕获膜的材质包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜。

根据本发明的另一方面，还公开了一种细小病毒检测试纸的制备方法，包括如下步骤：

s1：准备荧光微球与细小病毒抗原抗体；

s2：荧光微球与细小病毒抗体耦联，获得荧光微球标记的细小病毒检测抗体；

s3：荧光微球标记的细小病毒检测抗体处理被0.1％-10％的nacl溶液浸泡的标记物垫，细小病毒捕获抗体以及阳性对照抗体处理捕获膜；

s4：试纸条大卡的组装与切割，捕获膜首先粘贴在支撑底板上，在靠t线一侧先后粘贴标记物垫以及样品垫；在靠c线一侧粘贴吸水垫，然后用切割机切割成4-5mm宽的试纸，于铝箔袋中封闭保存备用。

优选的，所述荧光微球包括但不限于球体中包埋了荧光分子的二氧化硅微球、聚苯乙烯微球；所述微球直径在10nm-10μm之间，其表面带有羧基、氨基或酮基的修饰官能团。

本发明还公开了一种基于荧光免疫层析技术的细小病毒检测试纸在检测细小病毒成分中的应用。

优选的，所述试纸检测的细小病毒成分包括但不限于犬细小病毒、猫细小病毒。

本发明的有益效果：

1.本发明的检测试纸，前期用nacl溶液对标记物垫进行浸泡处理，处理后的试纸在检测过程中，可以有效的消除细小病毒检测试纸的假阳问题，且检测灵敏度高，可检测到10ng/ml的细小病毒抗原。

2.检测稳定性强、速度快；可以及时应对突发性感染的快速分析，以便对感染细小病毒的犬或猫及时采取补救措施或治疗手段，提高幼犬/猫的成活率。

附图说明

图1是本发明中用于检测细小病毒的试纸示意图；

图2是用荧光免疫层析和胶体金免疫层析检测细小病毒的结果比较图；

图中，1-样品垫；2-标记物垫；3-捕获膜；4-吸水垫；5-pvc底板；6-c线；7-t线。

具体实施方式

下面将结合附图与实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。

实施例1

如图1所示，本发明基于荧光免疫层析技术的细小病毒检测试纸，包括pvc底板5及粘贴在pvc底板5上表面的样品垫1、标记物垫2、捕获膜3、吸水垫4，相邻的每一部分均在边接处交叠边接，所述捕获膜3上含有c线6和t线7；所述标记物垫2含有0.1％-10％的nacl浸泡液、荧光微球标记的细小病毒检测抗体及生物素标记的细小病毒捕获抗体或者含有荧光微球标记的对照蛋白或抗体；所述t线7含有捕获探针；所述c线6含有能结合细小病毒检测抗体的二抗或者含有可做阳性对照的抗体。

在本实施例中，当标记物垫2用不含nacl的浸泡液处理后，制备的试纸当天检测缓冲液没有假阳，但是1周后所有试纸用不含细小病毒的缓冲液检测时都出现假阳，而且随着保存时间的延长假阳增加，会严重影响检测结果的准确性。当将标记物垫2用含有nacl的溶液进行前期处理，制备的试纸用不含细小病毒的缓冲液检测时，不仅制备当天没有假阳，保存了1周、1月甚至1年的试纸在检测时都无假阳；说明标记物垫2用含有nacl的溶液进行前期处理可有效的消除试纸假阳性的问题。标记物垫2含有的荧光微球标记的对照蛋白或抗体，可以是链亲和素或兔抗体；标记物垫2同时含有荧光微球标记的细小病毒检测抗体和生物素标记的细小病毒捕获抗体；所述t线含有细小病毒捕获抗体或者链亲和素；所述c线含有能结合细小病毒检测抗体的二抗，也可含有其他可做阳性对照的蛋白或抗体，如生物素标记的牛血清白蛋白或卵清蛋白，或者羊抗兔抗体、羊抗鼠抗体；本发明的检测试纸灵活性、准确度更高。

更具体的，捕获膜3的材质可以是硝酸纤维素膜(nc膜)、尼龙膜等，样品垫1为玻璃纤维、滤纸或滤血膜中的一种；标记物垫2为玻璃纤维、滤纸或聚酯膜中的一种；其中，当样品垫1和标记物垫1材质相同时可整合在一起，用一条玻璃纤维、滤纸或聚酯膜来完成样品垫1和标记物垫2的功能；将标记物垫和样品垫合并在一起，这样可减少裁剪、处理和粘贴，减少检测试纸生产中过多的工序造成的人力成本、时间的浪费，在保证检测准确度的前提下又能达到快速检测的目的。

本实施例中，所述荧光微球标记的细小病毒检测抗体是指跟荧光微球耦联的细小病毒检测抗体，更具体的说是，细小病毒检测抗体为用细小病毒的蛋白免疫动物后，动物血液中出现的能跟细小病毒特异性结合的抗体。

所述捕获探针是指结合在试纸条捕获膜上的细小病毒捕获抗体，更具体的说是，细小病毒捕获抗体为用细小病毒蛋白免疫动物后，动物血液中出现的能跟细小病毒特异性结合的抗体，但是细小病毒捕获抗体与细小病毒检测抗体识别细小病毒蛋白的不同部位，两个抗体分别识别并结合细小病毒蛋白后靠双抗体夹心法识别细小病毒。

实施例2

基于图1所示的细小病毒检测试纸，本发明提供了一种制备方法，具体包括如下步骤：

s1：准备荧光微球与细小病毒抗体；

s2：荧光微球与细小病毒抗体耦联，获得荧光微球标记的细小病毒检测抗体；

(201)将200μl20mmpbs,ph7.4，固含量1％的荧光微球与6mg碳化二亚胺混合，室温下振荡反应30min，12000rpm离心10min，用0.1m硼酸盐缓冲液清洗2次，获得活化后的荧光微球；

(202)将活化的荧光微球重悬于300μl硼酸盐缓冲液中，在微球悬液中加入200μl1mg/ml的细小病毒抗体，在室温下振荡反应12-16h；

(203)将反应后的溶液于12000rpm离心10min，加入400μl0.25m乙醇胺在室温下再振荡反应30min，将反应后的溶液再次离心，然后再用pbs缓冲液洗2次；

(204)离心沉淀后加入300μl2mg/ml的bsa重悬，室温下振荡反应30min后用pbs洗3次，再用200μl50mmpbs，ph7.4，0.1％tween20，5％蔗糖重悬荧光微球标记的细小病毒抗体，最终获得荧光微球标记的细小病毒检测抗体；

s3：荧光微球标记的细小病毒检测抗体处理标记物垫2，细小病毒捕获抗体以及阳性对照抗体处理捕获膜3；

(301)将标记物垫2用10ml50mmpbs，ph7.4，5％蔗糖，2％bsa，2％peg10000，0.1％-10％nacl溶液分别浸泡2min，然后置于37℃恒温箱中干燥1-2h；

(302)用荧光微球标记的细小病毒检测抗体处理标记物垫2，细小病毒捕获抗体以及阳性对照抗体处理捕获膜3；

(303)将荧光微球标记的细小病毒检测抗体溶液用喷膜仪喷到经过处理的标记物垫2上，喷速为10μl/cm；

(304)将1mg/ml细小病毒捕获抗体以及1mg/ml阳性对照抗体，用喷膜仪划线捕获膜3，划线速度为3μl/cm，然后将喷好的标记物垫2和捕获膜3置于37℃恒温箱中干燥1-2h；

(305)再将标记物垫2上含有荧光微球标记的细小病毒抗体部分切割下来，得到4-5mm宽，30cm长的条带；

s4：试纸条大卡的组装与切割，捕获膜3首先粘贴在pvc底板5上，在靠t线7一侧先后粘贴标记物垫2以及样品垫1，在靠c线6一侧粘贴吸水垫4；相邻的每一部分均在边接处交叠边接，然后用切割机切割成4-5mm宽的试纸，于铝箔袋中封闭保存备用。

本实施例中，所述荧光微球包括但不限于球体中包埋了荧光分子的二氧化硅微球、聚苯乙烯微球；所述微球直径在10nm-10μm之间，其表面可带有羧基、氨基或酮基等官能团。

所述荧光分子包括荧光素、罗丹明等荧光分子或其衍生物、铕复合物、钐复合物、铽复合物等镧系元素复合物荧光分子以及铂复合物、钯复合物等磷光分子；其中，铕复合物为铕与配体螯合后再与其他有机分子形成的复合物，铂复合物为铂与配体(包括卟啉、卟吩、吡啶及其衍生物)螯合形成的复合物；其中，铕复合物又为时间分辨荧光复合物，铂复合物又为磷光复合物。

所述细小病毒抗原抗体包括但不限于犬细小病毒、猫细小病毒抗原抗体，均购自抗体在线公司即(antibodies-online)公司；所述阳性对照抗体购买于美国sigma公司，喷膜仪购买于biodot公司，所述样品垫、标记物垫、捕获膜、吸水垫、pvc底板均购买于millipore公司；所述微球由长春志昂生物科技有限公司提供。

本发明制备细小病毒检测试纸的方法，制备简单；使用荧光微球与细小病毒抗体耦联，获得荧光微球标记的细小病毒检测抗体，使得制备的试纸在检测过程中具备更高的灵敏度，检测准确度更高；对标记物垫用0.1％-10％的nacl溶液进行前处理，能有效消除细小病毒荧光免疫层析试纸的假阳性，可以提高产品的稳定性。

实施例3

将制得的试纸用于检测细小病毒抗原，具体步骤如下：

将100μl含0ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml，10000ng/ml细小病毒抗原的溶液分别滴加荧光免疫层析试纸的样品垫上，反应10min后用发射激发光的荧光检测仪检测荧光信号；同时将100μl含0ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml，10000ng/ml细小病毒抗原的溶液滴加到胶体金免疫层析试纸条上，反应5min后观察结果。

如图2所示，经过对比可看出，在细小病毒抗原浓度为0ng/ml时，两种检测方法t线(下面那条线位置)都没有信号，说明两种方法都没有假阳性。而在加10ng/ml、100ng/ml、10³ng/ml细小病毒抗原时，只有荧光免疫层析方法的t线能检测出信号，而且随着抗原浓度升高荧光信号逐渐增强。当加10⁴ng/ml细小病毒抗原时，两种方法都能检测出信号，但是荧光免疫层析的检测信号要强很多。可见，荧光免疫层析比胶体金免疫层析灵敏，灵敏度近1000倍，而且不会出现假阳性结果。

对比例1

试纸的标记物垫经过0.1％-10％的nacl溶液处理，将100μl含0ng/ml细小病毒抗原的溶液(即缓冲液)分别滴加到样品垫上，反应10min后用发射激发光的荧光检测仪检测荧光信号。

对比例2

试纸的标记物垫不经过0.1％-10％的nacl溶液处理，将100μl含0ng/ml细小病毒抗原的溶液(即缓冲液)分别滴加到样品垫上，反应10min后用发射激发光的荧光检测仪检测荧光信号。

结果证明标记物垫处理液中不加nacl会使得细小病毒试纸条出现假阳，但是随着处理液中nacl浓度的升高，假阳逐渐降低，在nacl浓度为0.1％-10％时，假阳几乎为零，同时灵敏度最高。实验还证明，当nacl浓度高于10％时，t值均为零，但是灵敏度会有所降低，所以在标记物垫处理液中添加0.1％-10％的nacl可以有效消除细小病毒检测试纸的假阳问题，且灵敏度高、稳定性强。

在实施例3、对比例1、2中使用的荧光检测仪为上海海跃塑模有限公司提供的395nm荧光检测仪。

本发明检测方法的工作原理是：如图1所示，当样品溶液滴加到试纸的样品垫1上后，液体将沿水平箭头方向移动，先到达标记物垫2，样品中的细小病毒与标记物垫2中荧光微球标记的细小病毒检测抗体结合形成‘细小病毒-细小病毒检测抗体-荧光微球’复合物；当溶液继续移动到达捕获膜的t线时，溶液中的‘细小病毒-细小病毒检测抗体-荧光微球’复合物将与此处的细小病毒捕获抗体形成‘细小病毒捕获抗体-细小病毒-细小病毒检测抗体-荧光微球’复合物，并被固定在t线上，随后用检测仪来检测t线上的荧光信号，根据信号强度可以判断细小病毒浓度的高低，荧光信号强则细小病毒浓度高。

由于t线处细小病毒捕获抗体捕获的荧光微球包含有很多荧光分子，所以t线处可以检测到很强的荧光信号，从而使这种免疫层析技术检测细小病毒的方法有很高的灵敏度。当荧光分子是时间分辨荧光复合物时，由于发射光有数百微秒到数毫秒的荧光寿命，可以在激发光撤掉后数十微秒到数百微秒检测发射光信号，此时激发光和背景荧光都已经消失，只有荧光分子特异的荧光信号，所以检测的特异性和灵敏度都得到了大大的提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。