基于双抗体夹心均相化学发光法猪瘟病毒检测试剂盒及其制备方法和应用与流程

文档序号:23697244发布日期:2021-01-23 11:03阅读:来源:国知局

技术特征:
1.一种基于双抗体夹心均相化学发光法猪瘟病毒检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括试剂r1、试剂r2、试剂r3、阳性对照和阴性对照,其中:所述试剂r1包括标记链霉亲和素的供体微球的缓冲液,所述供体微球能够在680nm光下激发产生单体氧;所述试剂r2包括标记抗猪瘟病毒单克隆抗体的受体微球的缓冲液,所述受体微球能够与单体氧反应生成可检测的615nm化学发光信号;所述试剂r3为生物素化的抗猪瘟病毒单克隆抗体的缓冲液。2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂r2中标记抗猪瘟病毒单克隆抗体的受体微球为标记抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体的受体微球,所述缓冲液组分为0.01m pbs缓冲液、2%bsa、0.1%proclin 300、5%蔗糖、0.1%tween-20,其余为纯化水,ph值为7.2。3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂r3中生物素化的抗猪瘟病毒单克隆抗体为生物素化的抗猪瘟病毒e2蛋白的单克隆抗体,所述生物素化的抗猪瘟病毒e2蛋白的单克隆抗体的浓度为0.5μg/ml,所述缓冲液组分为0.01m pbs缓冲液、2%bsa、0.1%proclin 300、5%蔗糖、0.1%tween-20,其余为纯化水,ph值为7.2。4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的阳性对照为灭活的猪瘟病毒荧光pcr ct值在25
±
1之间的猪血清;所述阴性对照为灭活的猪瘟病毒荧光pcr无ct值的猪血清。5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述的供体微球和受体微球的直径均为150nm。6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述的试剂r1中供体微球的浓度为5μg/ml;所述的试剂r2中受体微球的浓度为2μg/ml。7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述试剂r1的缓冲液组分为0.01m pbs缓冲液、2%bsa、0.1%proclin 300、0.1%tween-20,其余为纯化水,ph 7.2。8.一种制备如权利要求1所述试剂盒的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:8-1)试剂r1制备:a)供体微球准备:量取10mg 150nm的供体微球和1mg链霉亲和素,迅速混匀,再加入ph值为6.0的0.05m mes缓冲液调节供体微球浓度至10mg/ml;b)反应:加入100μl ph值为6.0的0.05m mes配制的50mg/ml的nabh3cn溶液,迅速混匀,室温旋转反应12~16h;c)封闭:加入ph值为6.0的0.05m mes缓冲液配制的浓度为100mg/ml的bsa溶液,其与反应液体积比为1:4,迅速混匀,室温旋转反应3小时;d)清洗:反应好的溶液4℃12000rpm离心60min,弃去上清,加入2mlph值为6.0的0.05m mes缓冲液超声悬浮,再次离心,弃去上清,最后用0.01m pbs缓冲液、2%bsa、0.1%proclin 300、0.1%tween-20,其余为纯化水,ph值为7.2的缓冲液溶解清洗好的供体微球,使其终浓度为5μg/ml,超声分散后置于4℃保存备用;8-2)试剂r2制备:a)受体微球准备:量取10mg 150nm的受体微球和2mg的抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体,迅速混匀,再加入ph值为6.0的0.05m mes缓冲液调节受体微球浓度至10mg/ml;
b)反应:加入100μl的ph值为6.0的0.05m mes配制的浓度为50mg/ml 的nabh3cn溶液,混匀,室温旋转反应12~16h;c)封闭:加入ph值为6.0的0.05m mes配制的浓度为100mg/ml的bsa溶液进行封闭,其与反应液体积比为1:4,迅速混匀,室温旋转反应3小时;d)清洗:反应好的溶液4℃12000rpm离心60min,弃去上清,加入2mlph值为6.0的0.05m mes缓冲液超声悬浮,再次离心,弃去上清,最后用0.01m pbs缓冲液、2%bsa、0.1%proclin 300、5%蔗糖、0.1%tween-20,其余为纯化水,ph值为7.2的缓冲液溶解上述步骤中制备的受体微球,使其终浓度为2μg/ml,超声分散后置于4℃保存备用;8-3)试剂r3制备a)生物素活化:量取1mg生物素加入到100μl dmf溶液中并充分混匀,再用pbs溶液定容到0.5ml,准确称取edc 2mg,加入该溶液中,室温活化1h;b)反应:量取一定量的抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体于pbs溶液中4℃过夜透析,测定抗体浓度并调节至2mg/ml,将活化好的生物素溶液加入抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体溶液中,充分混匀并在室温反应6h;c)纯化:将生物素化抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体溶液加入载留分子量为10kd的透析袋中,用pbs溶液作为缓冲液,在4℃透析24小时,取样测定抗体浓度,将质检合格的生物素化抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体浓度用0.01m pbs缓冲液、2%bsa、0.1%proclin 300、5%蔗糖、0.1%tween-20,其余为纯化水,ph值为7.2的缓冲液调节至0.5μg/ml,4℃保存备用。9.一种使用如权利要求1-8任一项所述的猪瘟病毒检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:9-1)将检测样品或者阳性对照或者阴性对照与试剂r1、试剂r2、试剂r3按照体积比为10μl:30μl:30μl:30μl的量混合,混合液置于37℃下避光温育10min;9-2)在温育后,立即通过光电倍增管检测该溶液的化学发光信号,检测时间3s,记录阳性对照、阴性对照和样本的化学发光值;9-3)根据化学发光值,计算s/p值,其中s/p值=(样品化学发光值-阴性对照化学发光值)/(阳性对照化学发光值-阴性对照化学发光值);当s/p值≥0.4时,判为猪瘟病毒阳性;当s/p值<0.4时,判为猪瘟病毒阴性。10.一种如权利要求1-8任一项所述的试剂盒在检测猪瘟病毒中的应用。
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