检测唾液新型冠状病毒N抗原的试剂盒及其应用方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒及其应用方法。

背景技术：

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征(sars)等较严重疾病。2020年1月31日，世界卫生组织建议将2019年出现的新型冠状病毒肺炎暂命名为“2019-ncovacuterespiratorydisease”，把病毒暂命名为“2019-ncov”(2019代表首次出现的年份，n表示novel(新)，cov表示coronavirus(冠状病毒))。2月7日，中国国家卫健委发出通知，决定将“新型冠状病毒感染的肺炎”暂命名为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”，英文名称为“novelcoronaviruspneumonia”，简称“ncp”。2月11日，世界卫生组织发布了新型冠状病毒感染引起的疾病的正式名称“covid-19”，其中“co”代表“corona(冠状物)”，“vi”代表“virus(病毒)”，“d”代表“disease(疾病)”。同日，国际病毒分类委员会(ictv)将新型冠状病毒命名为sars-cov-2，并强调了新病毒与sars病毒的相似性。人感染冠状病毒(2019-ncov)后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。新型冠状病毒肺炎疫情暴发以来，普通实时定量荧光pcr核酸检测试剂的迅速上市和临床应用在患者临床诊断和疑似患者排查中发挥了重要作用，但是，受操作繁琐、耗时长、需要集中送检等限制，还不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者等排查诊断的检测需求，因此，迫切需要一种现场快速检测产品，能够突破现有检测技术对人员/场所的限制，缩短检测用时，提升便捷程度，推动诊断前移下移，实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查。目前新型冠状病毒(2019-ncov)的病毒感染的快速检测，集中于对疑似患者血液中新冠病毒igg和igm抗体的检测，但直接针对新冠病毒抗原的快速检测产品，国内少见报道；因此开发一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒，对控制新型冠状病毒的疫情具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供了检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒及其应用方法，目的是为了解决目前新型冠状病毒(2019-ncov)的病毒感染的快速检测，集中于对疑似患者血液中新冠病毒igg和igm抗体的检测，但直接针对新冠病毒抗原的快速检测产品，国内少见报道的技术问题。

本发明提供的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒，具体技术方案如下：

检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒，包括检测卡，所述检测卡包括样品垫、胶体碳结合垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、反应支持物；

所述样品垫、所述胶体碳结合垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸依次粘贴在所述反应支持物上，所述样品垫的一端压覆所述胶体碳结合垫的一端，所述胶体碳结合垫的另一端压覆所述硝酸纤维素膜的一端，所述吸水滤纸压覆所述硝酸纤维素膜的另一端；所述胶体碳结合垫为含有胶体碳标记的mabn1的胶体碳垫；

所述mabn1表示抗新型冠状病毒n抗原的单克隆抗体1，所述新型冠状病毒n抗原的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述mabn1获取方法如下：通过所述新型冠状病毒n抗原作为免疫原免疫动物制备得到的一株单克隆抗体。

在某些实施方式中，所述硝酸纤维素膜设置有检测条带和质控条带，所述检测条带位于所述硝酸纤维素膜靠近所述胶体碳结合垫的一侧，所述检测条带含有mabn2，所述质控条带位于所述硝酸纤维素膜远离所述胶体碳垫的一侧，且含有羊抗鼠igg多克隆抗体；

所述mabn2表示抗新型冠状病毒n抗原的单克隆抗体2，所述mabn2和mabn1分别为所述新型冠状病毒n抗原不同表位的抗体，所述mabn2获取方法如下：通过所述新型冠状病毒n抗原作为免疫原免疫动物制备得到的另一株单克隆抗体。

在某些实施方式中，所述检测条带和所述质控条带的长度均为0.35-0.4cm，宽度均为0.5-1mm，所述检测条带和所述质控条带的间距均为3.5-4mm。

在某些实施方式中，还包括唾液采集器，所述唾液采集器的出液口可拆卸地连接所述胶体碳垫。

本发明还提供了检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒的应用方法，基于上述的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒，包括如下步骤：

s1，收集唾液样品；

s2，将样品垫与所述唾液样品接触至少2分钟，所述唾液样品将依次沿着反应支持物上的各个附着物向吸水滤纸的方向移动；

s3，当在观察窗口有液体出现时，将所述检测卡与所述唾液样品分离，并置于干净平整工作台，15分钟后获得对唾液中新型冠状病毒n抗原的检测结果。

在某些实施方式中，步骤s3中，若所述唾液样品中含有新型冠状病毒，在经过所述胶体碳垫的过程中，与所述胶体碳垫标记的mabn1特异性结合形成复合物；所述复合物在经过所述硝酸纤维素膜的过程中，与mabn2特异性结合，则检测条带处出现黑色，说明所述待测样本为阳性；

若所述唾液样品中不含有新型冠状病毒，则检测条带未出现黑色，样本为阴性；而胶体碳标记的mabn1继续前进与羊抗鼠igg多克隆抗体结合，质控条带处出现黑色。

在某些实施方式中，步骤s3中，如果质控条带处出现黑色，则表明胶体碳标记的mabn1与羊抗鼠igg多克隆抗体正常结合，实验结果有效；如果质控条带处未出现黑色，则表明胶体碳失效或者实验操作有误，实验结果无效。

本发明具有以下有益效果：新型冠状病毒基因组的两端分别包含一个非翻译区，分别为5'-utr、3'-utr，其中5'端约3/4包含2个大的重叠的开放读框orf1a和orf1b，主要用于编码与病毒复制转录有关的酶类等非结构蛋白，而3'端约1/4的基因用于编码表面棘突(spike，s)蛋白、膜(membrane，m)蛋白、小包膜(smallenvelopemembrane，e)蛋白及核衣壳(nucleocapsid，n)蛋白等主要结构蛋白。抗体的特异性，并不是针对抗原，而是针对某个特定的空间构象。n蛋白作为新型冠状病毒检测的靶点，可以有效避免提高检测的特异性，避免特异igm和igg免疫测定的假阳性。此外，新型冠状病毒感染机体后会大量增殖，使患者唾液中含有相当大载量的新型冠状病毒颗粒，因此对唾液中的新型冠状病毒进行检测，可以有效提高检测的效率。本发明提供的试剂盒，以n蛋白作为新型冠状病毒检测的靶点，选取唾液作为检测样本，能够简化新型冠状病毒的检测流程，不对任何实验仪器、环境或者操作人员具有依赖性，操作简单、方便、检测周期短、易于判读；另外，不需要特殊的仪器设备，不需要专业培训，适应性强，便于随时随地的监测和检验。

附图说明

图1是本发明的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒的正视图；

图2是本发明的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒的侧视图；

图3是本发明的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒的应用方法流程示意图；

图4是本发明的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒检测结果阳性示意图；

图5是本发明的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒检测结果阴性示意图；

图6是本发明的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒检测结果无效示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图1-6，对本发明进一步详细说明。

本发明提供的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒包括检测卡，所述检测卡由吸水滤纸1、硝酸纤维素膜2、胶体碳垫3、样品垫4和反应支持物5组成。样品垫4、胶体碳垫3、硝酸纤维素膜2和吸水滤纸1依次粘贴在反应支持物5上，样品垫4的一端压覆胶体碳垫3的一端，胶体碳垫3的另一端压覆硝酸纤维素膜2的一端，吸水滤纸1压覆硝酸纤维素膜2的另一端。其中反应支持物5可以为塑料胶板。吸水滤纸1可以防止样本在硝酸纤维素膜2的一端堆积，从而导致后续的样本无法继续前行，进而能够使反应充分。胶体碳垫3为含有胶体碳标记的抗新型冠状病毒n抗原的单克隆抗体1(简称mabn1)的胶体碳垫。优选的，硝酸纤维素膜2包括含有抗新型冠状病毒n抗原的单克隆抗体2(简称mabn2)的检测条带t，以及含有羊抗鼠igg多克隆抗体的质控条带c，检测条带t位于硝酸纤维素膜2靠近胶体碳结合垫3的一侧，质控条c带位于硝酸纤维素膜2远离胶体碳垫3的一侧。设有检测条带t和质控条带c的硝酸纤维素膜2粘贴在反应支持物5上。其中，mabn1和mabn2通过如下方法获得：通过所述新型冠状病毒n抗原(氨基酸序列如seqidno.1所示)作为免疫原免疫动物(比如小鼠)制备得到的多株单克隆抗体，筛选出效果较好的两株，一株标记为mabn1，另一株标记为mabn2。

优选地，检测条带t和质控条带c的长度均为0.35-0.4cm，宽度均为0.5-1mm，检测条带t和质控条带c的间距均为3.5-4mm。

本发明还提供了检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒的应用方法，基于上述的检测唾液新型冠状病毒n抗原的试剂盒，包括如下步骤：

s1，为了能够达到检测新型冠状病毒的目的，需要足量的唾液样品。

s2，将样品垫4与所述唾液样品接触至少2分钟，此处可以将检测卡的样品垫4浸入唾液样品中，或者通过唾液收集器，将唾液样品通过出液口滴在样品垫4上，此时唾液样品将依次沿着反应支持物5上的各个附着物向吸水滤纸1的方向移动，

s3，当在观察窗口有液体出现时，将所述检测卡与唾液样品分离(将样品垫4从唾液样品中取出，或者停止唾液收集器对样品垫4的滴液)，并置于干净平整工作台，15分钟后获得对唾液中新型冠状病毒n抗原的检测结果。

如果唾液样品中含有的新型冠状病毒时，与检测检测卡上的胶体碳标记的mabn1特异性结合形成复合物，而后继续前行，在经过硝酸纤维素膜2的过程中，与mabn2特异性结合，则检测条带t处出现黑色，说明所述待测样本为阳性，参照图4。

若唾液样品中不含有新型冠状病毒，则检测条带t未出现黑色，样本为阴性；而胶体碳标记的mabn1继续前进与羊抗鼠igg多克隆抗体结合，质控条c带处出现黑色，参照图5；

无论样本中是否含有新型冠状病毒，上述胶体碳标记的mabn1都会继续前行至质控条带c并与此处包被的羊抗鼠igg多克隆抗体结合，形成黑色条带，即为质控线。如果在检测过程中质控线中不出现，则证明胶体碳失效或者操作有失误，结果无效，需要重新检测，参照图6。

上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

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