本发明涉及结肠癌转移筛查试剂及其应用，具体涉及一种检测hrp2蛋白表达水平的试剂在制备结肠癌转移筛查试剂中的应用。
背景技术：
：全球结肠癌的发病率占所有恶性肿瘤第三位，病死率居第四位。随着生活方式、饮食习惯的改变，我国结肠癌的发病率和病死率亦在逐年增加。无序增殖和远处转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，其中远处转移是结肠癌预后不佳的重要因素。识别发生转移的结肠癌原发病灶的分子病理特征，对于早期识别结肠癌转移有着重要意义。结肠癌可以通过淋巴播散和血行播散，也可以经局部浸润和腹膜途径转移。最常见的转移部位是区域淋巴结、肝脏、肺和腹膜。结肠癌转移筛查，是指对于结肠癌诊断明确的患者，在临床出现转移之前及时识别出来。如果找到结肠癌转移的高危分子标记物，对于临床上制定治疗策略具有重要的参考价值。技术实现要素：为解决结肠癌转移早期识别问题，本发明对转移性结肠癌进行了详细研究，发现了肝癌衍生生长因子相关蛋白2(hepatoma-derivedgrowthfactor-relatedprotein2,hrp2)的表达水平和结肠癌转移呈正相关。通过检测结肠癌组织中hrp2的表达水平，可以预测受检结肠癌患者发生转移的风险。据此，本发明一方面提供了一种结肠癌转移筛查的试剂盒，所述试剂盒包括检测hrp2蛋白表达水平的试剂。本发明的结肠癌转移筛查的试剂盒，包括用于检测结肠癌组织中hrp2表达水平的试剂。其中，所述检测hrp2表达水平的试剂为免疫组化方法用试剂。本发明另一方面提供了检测hrp2表达水平的试剂在制备结肠癌转移筛查试剂中的用途。其中，所述检测结肠癌组织中hrp2表达水平的试剂为免疫组化方法用试剂。hrp2是hrp家族的一员，因首先在肝癌细胞中分离纯化而命名。既往研究在正常结肠组织中发现hrp2含量较低，然而，hrp2在结肠癌中的表达情况未见报道，更没有hrp2蛋白和结肠癌转移关系的报道。本发明试剂盒通过检测发生转移结肠癌病灶组织的hrp2表达水平，可以判断发生转移结肠癌的hrp2蛋白表达水平差异，进而判断受检的结肠癌患者发生转移的风险。若hrp2表达水平高，则发生转移的风险高，若hrp2表达水平低，则发生转移的风险低，可用于结肠癌转移的辅助诊断，临床应用前景良好。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。以下实施例向本领域普通技术人员提供如何制造和评价本发明，所述实施例仅是本公开内容的示范且不圈定限制范围。尽管已经尽力确保关于数值(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些误差和偏差。一、hrp2的表达水平与结肠癌转移的关系(一)实验方法1、临床资料选取结肠癌患者石蜡切片28例，其中发生区域淋巴结或远处转移的14例，无转移的14例。2、hrp2表达水平的检测(1)对结肠癌病灶组织进行石蜡切片，进行hrp2指标的免疫组化检测。(2)hrp2抗体：购自proteintech公司，货号15134-1-ap。(3)另外需准备如下试剂：二水柠檬酸钠、一水柠檬酸购自上海阿拉丁试剂有限公司；二甲苯、30％双氧水购自上海生工生物工程有限公司；封闭用血清工作液、dab显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；envisiontm+/hrp兔工作液、dako抗体稀释液购自丹麦dako公司；苏木素染色液购自海门碧云天生物技术研究所；浓盐酸购自美国sigma公司。(4)预先配置如下试剂备用：①抗原修复液0.1m柠檬酸钠溶液82ml0.1m的柠檬酸溶液18ml加双蒸水定容至1000ml。②0.25％的盐酸酒精1ml浓盐酸加入99ml70％乙醇中。③内源性过氧化物酶阻断剂无水甲醇38.4ml30％h2o212mlddh2o9.6ml(5)按照如下方法检测hrp2的表达水平①石蜡切片放入63℃烘箱中，烘蜡一小时；从烘箱内取出片子，进行脱蜡，脱蜡过程为：二甲苯2缸，每缸15min无水乙醇2缸，每缸7min90％酒精1缸，7min80％酒精1缸，7min70％酒精1缸，7min。②取出片子，ddh2o冲洗3min×3次。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至高压锅中加热；柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时5min。时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却至室温。③片子放入过氧化物酶阻断剂中，静置10min，取出片子，pbs5min×3次冲洗。④滴加1滴封闭用血清工作液，室温下孵育10min，倒去。⑤hrp2抗体用dako抗体稀释液稀释(1:100)，滴加到片子上，片子放入湿盒，4℃冰箱过夜。⑥从冰箱里取出湿盒，静置1h待其恢复到室温，pbs冲洗5min×3次。⑦滴加envisiontm+/hrp兔工作液，室温下孵育30min后，pbs冲洗5min×3次。⑧在片子上滴加新鲜配制的dab显色剂，显色5min后自来水冲洗15min。⑨在片子上滴加苏木素染色液，2min后再0.25％的盐酸酒精中浸没2s，自来水冲洗2min。⑩将片子脱水，脱水过程：75％酒精1缸，3min85％酒精1缸，3min95％酒精1缸，3min无水乙醇两缸，每缸5min二甲苯两缸，每缸5min。取出封片。3、免疫组化评分标准组织芯片免疫组化完成封片后，显微镜下拍照，定义无染色为hrp2阴性，染色为hrp2阳性。4、结果分析采用spss22.0软件对结肠癌发生转移与无转移组的病灶组织hrp2表达水平进行统计学分析。(二)、实验结果结肠癌发生转移与无转移组中原发病灶hrp2的检测结果如下表组别hrp2阴性hrp2阳性p值转移组3110.001无转移组122由上表可见，转移组结肠癌组织中hrp2阳性表达率为78.6％，无转移组结肠癌组织中hrp2的阳性表达率为14.3％，两者之间的差异具有统计学意义(p＝0.001)。由上结果可以看出，与未发生转移的结肠癌组织相比，发生转移结肠癌组织中hrp2的表达水平显著升高(p＝0.001)，说明结肠癌转移的发生和hrp2的表达水平呈正相关。因而，可以通过检测结肠癌组织中hrp2的表达水平，将结肠癌患者中容易发生转移的病例筛查出来。二、检测hrp2表达水平的试剂盒组成及其使用方法(一)、免疫组化检测试剂盒的组成检测试剂盒(25人份)，内含试剂如下：组分体积hrp2抗体15ulenvisiontm+/hrp兔二抗50ul封闭用血清工作液1ml抗体稀释液5mldab显色剂5ml苏木素染色液2ml抗原修复液1000ml0.25％的盐酸酒精1000ml内源性过氧化物酶阻断剂60ml(二)、试剂盒的使用方法将待检结肠癌组织，制备石蜡切片，按照如下方法检测hrp2的表达水平：①石蜡切片放入63℃烘箱中，烘蜡一小时；从烘箱内取出片子，进行脱蜡，脱蜡过程为：二甲苯2缸，每缸15min无水乙醇2缸，每缸7min90％酒精1缸，7min80％酒精1缸，7min70％酒精1缸，7min。②取出片子，ddh2o冲洗3min×3次。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至高压锅中加热；柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时5min。时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却至室温。③片子放入过氧化物酶阻断剂中，静置10min，取出片子，pbs5min×3次冲洗。④滴加1滴封闭用血清工作液，室温下孵育10min，倒去。⑤hrp2抗体用dako抗体稀释液稀释(1:100)，滴加到片子上，片子放入湿盒，4℃冰箱过夜。⑥从冰箱里取出湿盒，静置1h待其恢复到室温，pbs冲洗5min×3次。⑦滴加envisiontm+/hrp兔工作液，室温下孵育30min后，pbs冲洗5min×3次。⑧在片子上滴加新鲜配制的dab显色剂，显色5min后自来水冲洗15min。⑨在片子上滴加苏木素染色液，2min后再0.25％的盐酸酒精中浸没2s，自来水冲洗2min。⑩将片子脱水，脱水过程：75％酒精1缸，3min85％酒精1缸，3min95％酒精1缸，3min无水乙醇两缸，每缸5min二甲苯两缸，每缸5min。取出封片。显微镜下拍照，对染色细胞的染色情况进行观察，确定结肠癌转移的风险。综上，本发明试剂盒通过检测结肠癌组织中hrp2蛋白的表达水平，可以预测转移发生的风险，为临床识别结肠癌转移提供依据，具有良好的临床应用价值。当前第1页12