一种利用荧光增强法检测谷胱甘肽的方法

1.本发明属于小分子生物硫醇化合物检测技术领域，尤其是一种利用荧光增强法检测谷胱甘肽的方法。


背景技术：

2.谷胱甘肽是哺乳动物和真核细胞生物活细胞中最主要的非蛋白质硫醇化合物，是一种重要的内源性抗氧化剂、解毒剂，在清除生物体系中自由基方面发挥重要作用。谷胱甘肽是防御有毒物质的第一道防线，可广泛参与人体免疫调节、新陈代谢、能量运输和其他生理过程。它在维持细胞氧化还原稳态、细胞信号转导、解毒等方面发挥着关键作用。通常，人体中谷胱甘肽浓度的不平衡会导致许多疾病，例如白细胞缺失、牛皮癣、肝损伤、癌症、人类免疫缺陷病毒(hiv)、阿尔茨海默病、糖尿病、帕金森病、心血管疾病和炎症。除了这些作用之外，谷胱甘肽还被用作成瘾成分并添加到食品和天然化妆品中。
3.到目前为止，已经开发出了许多定量检测谷胱甘肽的方法，如比色法、电化学法、酶法、高效液相色谱法、质谱法、电致化学发光法、表面增强拉曼散射、光电化学方法、酶联免疫吸附测定、毛细管电泳法、伏安法和荧光光谱法。荧光光谱法具有灵敏度高、灵活性好、操作简单以及非破坏性检测等优点，近年来，荧光光谱法成为了一种有前景的谷胱甘肽检测方法。
4.迄今为止，研究人员已经设计了许多有机荧光团，基于不同的传感机理(环化、迈克尔加成、二硫化物和磺酰胺裂解、巯基亲核取代和金属络合物错位配位等)来检测谷胱甘肽。尽管这些有机荧光材料很实用，但它们中的大多数仍然存在成本高、耗时、样品纯化步骤复杂等局限；在生物应用方面还存在光漂白、稳定性差、生物相容性差等缺点。因此，非常需要开发具有理想生物和环境安全性、高荧光强度和低成本的新型荧光纳米材料；建立一种高灵敏度、高选择性、低成本和操作简单的谷胱甘肽新检测方法具有重要意义。
5.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

6.本发明目的在于现有技术中的不足之处，提供一种利用荧光增强法检测谷胱甘肽的方法。
7.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.一种利用荧光增强法检测谷胱甘肽的方法，步骤如下：
9.⑴
将荧光材料和谷胱甘肽置于水中，混合均匀，荧光材料的终浓度为0.001
‑
0.1mg
·
ml
‑1，谷胱甘肽的终浓度为6.0
×
10
‑
10
‑
1.0
×
10
‑3mg
·
ml
‑1；
10.⑵
将表面活性剂、阳离子和阴离子加入到上述混合溶液中，构成荧光检测谷胱甘肽的体系；其中，表面活性剂的质量终浓度为0.01％
‑
0.1％，阳离子的浓度为10μg
·
ml
‑1‑
150μg
·
ml
‑1，阴离子浓度为2.3
×
10
‑
10
mol
·
l
‑1‑
2.5
×
10
‑1mol
·
l
‑1；
11.⑶
将上述配制好的荧光检测体系混合均匀后，置于20
‑
40℃的环境中待测；
12.⑷
采用980nm激发照射荧光检测体系，记录550nm处荧光强度f数值，即得。
13.而且，所述步骤
⑴
中荧光材料为以乙酸钇四水合物为主体发光基质，乙酸镱(iii)四水合物为敏化剂，醋酸铒(iii)水合物为激活剂，油酸为配体和溶剂，以及1
‑
十八烯为高沸点溶剂，通过溶剂热法制备得到的上转换荧光纳米材料。
14.而且，所述上转换荧光纳米材料的具体制备步骤如下：
15.将发光材料主体、敏化剂和上转换材料的激活剂置于三口烧瓶中，然后再向三口烧瓶中加入油酸和1
‑
十八烯，放入磁力搅拌子，再将三口烧瓶置于控温加热套中，进行磁力搅拌；其中，所述发光材料主体、敏化剂和上转换材料的激活剂三者间的物质的量之比为38
‑
40:9
‑
11:1
‑
2，油酸和1
‑
十八烯的体积比为5
‑
7:16
‑
18，发光材料主体与油酸的比例mg:ml为250
‑
270:5
‑
7；
16.在氩气保护下，三口烧瓶中的混合物在磁力搅拌下逐渐升温至100℃后关氩气，抽真空，待溶液整个液面没有气泡出现时，停止抽真空，通氩气；继续加热，直到溶液温度升至160℃，反应维持30min后冷却至室温；将氢氧化钠和氟化铵固体加入到甲醇中，超声至其完全溶解；然后将氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液缓慢逐滴加入三口烧瓶中，继续搅拌30min；其中所述氟化铵固体、氢氧化钠固体和甲醇的比例mg:mg:ml为14
‑
15:10
‑
11:1
‑
2，发光材料主体与氢氧化钠固体的比例mg:mg为25
‑
27:10
‑
11；
17.将溶液升温至100℃以蒸馏甲醇，当观察到体系中无甲醇蒸馏出时，停止通氩气并抽真空至反应体系无气泡后，关掉真空泵，继续通氩气；继续加热至溶液温度达到300℃，恒温反应1h，自然冷却至室温；将三口烧瓶中的溶液在10000r/min转速下离心10min，用无水乙醇洗涤三遍，60℃真空干燥24h，即得上转换荧光纳米材料。
18.而且，所述步骤
⑵
中表面活性剂为聚乙烯醇、明胶、吐温80、曲拉通x
‑
100中的一种或两种以上。
19.而且，所述步骤
⑵
中阳离子为na
+
、al
3+
、ag
+
、k
+
、cu
2+
中的一种或两种以上。
20.而且，所述步骤
⑵
中阴离子为cl
‑
、i
‑
、br
‑
中的一种或两种以上。
21.而且，所述步骤
⑷
中采用980nm外源激光器作为激发光源照射荧光待测体系，记录在550nm处的荧光强度数值。
22.如上所述的利用荧光增强法检测谷胱甘肽的方法在谷胱甘肽检测方面中的应用。
23.本发明取得的优点和积极效果为：
24.1、本方法利用上转换纳米材料在近红外光激发下能发射出可见光的特性，且在含有表面活性剂、阳离子和阴离子的体系可增强上转换纳米材料的荧光，据此高灵敏传感检测体系中谷胱甘肽，且该方法选择性高，稳定性好。
25.2、本发明方法改变了传统荧光法测定谷胱甘肽的方法，首次提出非修饰上转换纳米粒子直接作为荧光检测信号物，相比于其他需要复杂修饰的荧光探针，该方法具有快速，简单，省时等优点。
26.3、本发明方法通过向含有上转换荧光纳米材料和谷胱甘肽的荧光检测体系中加入表面活性剂、阳离子和阴离子，使得上转换纳米材料荧光强度增强，可以更好地传感检测谷胱甘肽，对谷胱甘肽检测线性范围为0.75nm
‑
0.75μm，检测线性范围较宽，且检出限较低。
27.4、本发明选取了15种常见的氨基酸作为谷胱甘肽干扰物进行选择性实验的测定。分别对l
‑
苯丙氨酸，l
‑
谷氨酸，色氨酸，l
‑
胱氨酸，酪氨酸，l
‑
天门冬氨酸，l
‑
组氨酸，l
‑
脯氨
酸，丙氨酸，l
‑
半胱氨酸，l
‑
精氨酸，l
‑
赖氨酸，l
‑
丝氨酸，l
‑
缬氨酸和甘氨酸进行荧光测试。结果显示，本传感检测方法对谷胱甘肽检测具有较好的选择性。
28.5、本发明改变了传统荧光法测定谷胱甘肽的方法，选择未被修饰的上转换材料作为荧光材料、聚乙烯醇作为表面活性剂、ag
+
为阳离子、i
‑
为阴离子，利用聚乙烯醇、ag
+
和i
‑
对上转换纳米材料的增敏作用，建立了一种基于上转换纳米材料荧光增强的快速、高灵敏检测谷胱甘肽的方法。
附图说明
29.图1为本发明中在最优条件下传感检测溶液中谷胱甘肽时不同浓度谷胱甘肽对上转换荧光纳米材料荧光光谱的影响图；
30.图2为本发明中上转换纳米材料荧光强度f与谷胱甘肽浓度负对数(
‑
log c
gsh
)的线性关系图；
31.图3本发明中对谷胱甘肽(gsh)进行选择性实验的测定荧光图；其中，干扰物质分别为：l
‑
苯丙氨酸(phe)，l
‑
谷氨酸(glu)，色氨酸(trp)，l
‑
胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，l
‑
天门冬氨酸(asp)，l
‑
组氨酸(his)，l
‑
脯氨酸(pro)，丙氨酸(ala)，l
‑
半胱氨酸(cys)，l
‑
精氨酸(arg)，l
‑
赖氨酸(lys)，l
‑
丝氨酸(ser)，l
‑
缬氨酸(val)和甘氨酸(gly)。
具体实施方式
32.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
33.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
34.一种利用荧光增强法检测谷胱甘肽的方法，步骤如下：
35.⑴
将荧光材料和谷胱甘肽置于水中，混合均匀，荧光材料的终浓度为0.001
‑
0.1mg
·
ml
‑1，谷胱甘肽的终浓度为6.0
×
10
‑
10
‑
1.0
×
10
‑3mg
·
ml
‑1；
36.⑵
将表面活性剂、阳离子和阴离子加入到上述混合溶液中，构成荧光检测谷胱甘肽的体系；其中，表面活性剂的质量终浓度为0.01％
‑
0.1％，阳离子的浓度为10μg
·
ml
‑1‑
150μg
·
ml
‑1，阴离子浓度为2.3
×
10
‑
10
mol
·
l
‑1‑
2.5
×
10
‑1mol
·
l
‑1；
37.⑶
将上述配制好的荧光检测体系混合均匀后，置于20
‑
40℃的环境中待测；
38.⑷
采用980nm激发照射荧光检测体系，记录550nm处荧光强度f数值，即得。
39.较优地，所述步骤
⑴
中荧光材料为以乙酸钇四水合物(y(ch3coo)3·
4h2o)为主体发光基质，乙酸镱(iii)四水合物(yb(ch3coo)3·
4h2o)为敏化剂，醋酸铒(iii)水合物(er(ch3coo)3·
xh2o)为激活剂，油酸(oa)为配体和溶剂，以及1
‑
十八烯(ode)为高沸点溶剂，通过溶剂热法制备得到的上转换荧光纳米材料。
40.较优地，所述上转换荧光纳米材料的具体制备步骤如下：
41.将发光材料主体、敏化剂和上转换材料的激活剂置于三口烧瓶中，然后再向三口烧瓶中加入油酸和1
‑
十八烯，放入磁力搅拌子，再将三口烧瓶置于控温加热套中，进行磁力搅拌；其中，所述发光材料主体、敏化剂和上转换材料的激活剂三者间的物质的量之比为38
‑
40:9
‑
11:1
‑
2，油酸和1
‑
十八烯的体积比为5
‑
7:16
‑
18，发光材料主体与油酸的比例mg:
ml为250
‑
270:5
‑
7；
42.在氩气保护下，三口烧瓶中的混合物在磁力搅拌下逐渐升温至100℃后关氩气，抽真空，待溶液整个液面没有气泡出现时，停止抽真空，通氩气；继续加热，直到溶液温度升至160℃，反应维持30min后冷却至室温；将氢氧化钠和氟化铵固体加入到甲醇中，超声至其完全溶解；然后将氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液缓慢逐滴加入三口烧瓶中，继续搅拌30min；其中所述氟化铵固体、氢氧化钠固体和甲醇的比例mg:mg:ml为14
‑
15:10
‑
11:1
‑
2，发光材料主体与氢氧化钠固体的比例mg:mg为25
‑
27:10
‑
11；
43.将溶液升温至100℃以蒸馏甲醇，当观察到体系中无甲醇蒸馏出时，停止通氩气并抽真空至反应体系无气泡后，关掉真空泵，继续通氩气；继续加热至溶液温度达到300℃，恒温反应1h，自然冷却至室温；将三口烧瓶中的溶液在10000r/min转速下离心10min，用无水乙醇洗涤三遍，60℃真空干燥24h，即得上转换荧光纳米材料。
44.较优地，所述步骤
⑵
中表面活性剂为聚乙烯醇、明胶、吐温80、曲拉通x
‑
100中的一种或两种以上。
45.较优地，所述步骤
⑵
中阳离子为na
+
、al
3+
、ag
+
、k
+
、cu
2+
中的一种或两种以上。
46.较优地，所述步骤
⑵
中阴离子为cl
‑
、i
‑
、br
‑
中的一种或两种以上。
47.较优地，所述步骤
⑷
中采用980nm外源激光器作为激发光源照射荧光待测体系，记录在550nm处的荧光强度数值。
48.如上所述的利用荧光增强法检测谷胱甘肽的方法在谷胱甘肽检测方面中的应用。
49.具体地，相关制备及检测如下：
50.一、加标回收法检测人血清中的谷胱甘肽：
51.实验步骤如下：
52.(1)将上转换纳米荧光材料和谷胱甘肽置于水中，混合均匀，荧光材料的终浓度为0.01mg
·
ml
‑1，谷胱甘肽的终浓度分别为7.5
×
10
‑
10
mol
·
l
‑1，1.2
×
10
‑9mol
·
l
‑1，7.5
×
10
‑9mol
·
l
‑1，1.2
×
10
‑8mol
·
l
‑1，7.5
×
10
‑8mol
·
l
‑1，1.2
×
10
‑7mol
·
l
‑1，7.5
×
10
‑7mol
·
l
‑1。
53.(2)将聚乙烯醇、ag
+
和i
‑
加入到上述混合溶液中，构成荧光检测谷胱甘肽的体系。其中，表面活性剂的质量终浓度为0.04％，ag
+
的浓度为100μg
·
ml
‑1，i
‑
浓度为2.4
×
10
‑4mol
·
l
‑1。
54.(3)将上述配制好的荧光检测体系混合均匀后，置于20
‑
40℃的环境中待测。
55.(4)采用980nm外源激光器作为激发光源照射荧光检测体系，得到不同谷胱甘肽浓度下，上转换纳米材料的荧光光谱曲线图，如图1所示，由图可知，上转换纳米材料在550nm处荧光强度随着谷胱甘肽浓度的增加而逐渐增强；
56.记录550nm处荧光强度f数值，绘制标准曲线，如图2所示，上转换纳米材料荧光强度f与gsh浓度负对数在gsh水溶液浓度为7.5
×
10
‑
10
mol
·
l
‑1、1.2
×
10
‑9mol
·
l
‑1、7.5
×
10
‑9mol
·
l
‑1、1.2
×
10
‑8mol
·
l
‑1、7.5
×
10
‑8mol
·
l
‑1、1.2
×
10
‑7mol
·
l
‑1、7.5
×
10
‑7mol
·
l
‑1时呈线性相关性，线性回归方程为：f＝
‑
484.7725(
‑
log c
gsh
)+6586.304，线性相关系数r2＝0.9944，线性范围为0.75nm～0.75μm。根据3σ规则(lod＝3σ/s)，计算出gsh最低检出限(lod)为3.5
×
10
‑
10
mol
·
l
‑1。
57.(5)取出1ml人血清样品稀释100倍，稀释液离心后取上清液进行加标回收实验。分别加标1nmol
·
l
‑1，10nmol
·
l
‑1，100nmol
·
l
‑1的谷胱甘肽按照(1)
‑
(4)中实验步骤进行操
作。
58.所的实验结果如下表所示：
59.表1加标回收实验
[0060][0061]
二、计算荧光变化值δf：
[0062]
(1)将上转换纳米荧光材料分别加入到16种目标物的水溶液中，混合均匀，荧光材料的终浓度为0.01mg
·
ml
‑1，l
‑
苯丙氨酸，l
‑
谷氨酸，色氨酸，l
‑
胱氨酸，酪氨酸，l
‑
天门冬氨酸，l
‑
组氨酸，l
‑
脯氨酸，丙氨酸，l
‑
半胱氨酸，l
‑
精氨酸，l
‑
赖氨酸，l
‑
丝氨酸，l
‑
缬氨酸，甘氨酸和谷胱甘肽终浓度均为7.5
×
10
‑5mol
·
l
‑1。
[0063]
(2)将聚乙烯醇、ag
+
和i
‑
加入到上述16种混合溶液中，构成荧光检测目标物的体系。其中，表面活性剂的质量终浓度为0.04％，ag
+
的浓度为100μg
·
ml
‑1，i
‑
浓度为2.4
×
10
‑4mol
·
l
‑1。
[0064]
(3)将上述配制好的荧光检测体系混合均匀后，置于20
‑
40℃的环境中待测。
[0065]
(4)采用980nm外源激光器作为激发光源照射荧光检测体系，记录550nm处荧光强度f数值，计算得到各组荧光变化值δf，如图3所示，由图可知本发明传感检测方法对gsh检测具有较好的选择性。
[0066]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。