一种利用风味指纹图谱鉴定酸奶中的发酵剂的方法与流程

本发明涉及饮用型酸奶风味指纹图谱的构建方法领域，尤其涉及一种利用风味指纹图谱鉴定酸奶中的发酵剂的方法。

背景技术：

饮用型酸奶是利用以益生菌为主的微生物发酵剂接种于新鲜牛乳，通过乳酸发酵而得到的发酵乳制品，具有细腻的凝块和特别芳香风味，其风味主要由益生菌在发酵过程中的代谢产物产生。饮用型酸奶中含有丰富的蛋白质、氨基酸、有机酸、b族维生素及乳酸菌活菌，其具有较高的营养价值和生理功能。

现有技术中大多利用pcr、非线性方法建立酸奶的指纹图谱。而本专利中利用气相色谱质谱联用测定风味成分从而建立饮用型酸奶风味指纹图谱。饮用型酸奶风味指纹图谱能对酸奶风味这一品质因素从整体上进行描述，全面反映酸奶质量，为酸奶品质判断提供一种快速、简便的方法。同时为研究发酵剂菌种鉴别提供良好的理论依据及技术支持。通过利用不同品牌发酵剂各自特征风味物质能够对不同品牌发酵剂鉴定，快速检测出假冒伪劣的品牌。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种用于鉴定饮用型酸奶普通菌种的风味指纹图谱；

本发明的目的之二是将所述的普通发酵剂风味指纹图谱应用于鉴别直投式酸奶菌种。

本发明的目的之三是通过利用不同品牌发酵剂各自特征风味物质对品牌区分，可快速检测出假冒伪劣品牌。

为了实现上述目的并解决现有技术中的问题，本发明提供了一种利用风味指纹图谱鉴定酸奶中的发酵剂的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)制作饮用型酸奶作；(2)利用顶空固相微萃取进行前处理，将得到的萃取物利用气相色谱-质谱联用测定饮用型酸奶样品的挥发性风味物质；(3)构建所述饮用型酸奶风味指纹图谱；(4)利用所述特征物质鉴定不同品牌发酵剂。

在一些优选的实施方式中，所述饮用型酸奶的制作方法如下：先将原料乳进行预热，然后牛奶、蔗糖和稳定剂混溶后进行均质，随后采用高温巴氏灭菌，灭菌条件为90-95℃，3-5分钟；在无菌操作条件下添加所述发酵剂，充分搅拌均匀后，在42℃培养5-7小时；发酵结束后进行后均质，再置于3～4℃冰箱中进行后熟10-12h，得到所述饮用型酸奶。

在另一些优选的实施方式中，所述顶空固相微萃取步骤中的顶空固相微萃取处理方法如下：取5ml样品置于顶空瓶中，水浴平衡后，将经过老化处理的固相微萃取头通过瓶盖的橡皮垫插入到样品瓶中，推出纤维头，于45℃水浴中吸附45min。

在另一些优选的实施方式中，所述色谱质谱测定条件如下：仪器型号：岛津qp-2010气相色谱一质谱联用仪；色谱柱一db-wax石英毛细管柱；升温程序：起始温度为30-40℃，保持2-3min，以5-6℃/min升温到180℃-200℃，保持1min，7-10℃/min升温到230-250℃，保持5-7min；进样口温度：250℃；传输线：230℃；载气：氦气；流速0.8-3.0ml/min；不分流进样。进样方式：不分流进样；电离方式：ei；电子能量：70ev；离子源温度：200-220℃；接口温度：200-220℃；溶剂延迟时间：1.5-3min。

在另一些优选的实施方式中，在构建所述饮用型酸奶风味指纹图谱时，采用10个不同酸奶样品按照步骤(1)和步骤(2)进行制作和处理，对酸奶中的风味成分进行定性定量分析，得到色谱图；求出色谱图中其他挥发性化合物的相对峰面积和相对保留时间，最后选择相对峰面积sr>1％的色谱峰作为样品的特征峰，从中筛选出15个共有峰作为指纹图谱的特征峰，所述15个共有峰依次为如下物质的峰：乙醛、双乙酰、2-庚酮、乙偶姻、2-壬酮、壬醛、乙酸、2-乙基己醇、癸醛、正辛醇、丁酸、己酸、辛酸、己二酸二辛酯。

在另一些优选的实施方式中，选择乙酸作为所述饮用型酸奶的风味指纹图谱的参照物；运用excel对指纹图谱的相似度进行计算；运用origin9.0对数据进行处理。

在另一些优选的实施方式中，所述步骤(3)包括如下子步骤：

(a)指纹图谱方法学验证；(b)共有峰的筛选；(c)参照物的选择；(d)指纹图谱相似度评价；(e)饮用型酸奶的特征风味指纹图谱的验证。

在另一些优选的实施方式中，所述发酵剂包含普通菌种保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌。

在另一些优选的实施方式中，在步骤(4)中，所述鉴定为将利用普通菌种保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌发酵得到的饮用型酸奶与其它菌种发酵得到的酸奶区分开。

在另一些优选的实施方式中，在步骤(4)中，利用特征物质鉴定饮用型酸奶中的不同品牌发酵剂，其中对酸奶中的风味成分进行定性定量分析，找出各个品牌发酵剂单独共有的物质作为特征物质，从而用于鉴定饮用型酸奶中的不同品牌发酵剂。

本发明利用不同类型发酵剂制作饮用型酸奶，利用顶空固相微萃取的方法测定不同酸奶风味成分，所得数据经计算机在nist标准谱库检索，分别对各峰所代表的风味物质的化学结构和名称加以确认，进行定性，采用峰面积归一法进行定量分析。一方面将筛选出的共有峰作为指纹图谱的特征峰，建立共有峰指纹图谱。建立的饮用型酸奶风味指纹图谱能够较好表征保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌酸奶的菌种属性，共有峰的指纹图谱能够将不同菌种酸奶区分，为酸奶菌种的判别验证技术提供技术支撑。另一方面，筛选出各品牌特有的风味物质，用来对品牌进行区分。

附图说明

图1：是本发明含14种特征物质的普通菌种酸奶风味指纹图谱。

图2：是本发明普通菌种与其他菌种区分应用图。

图3：是本发明不同品牌发酵剂酸奶各自特征物质风味指纹图谱。

图4：是本发明不同品牌酸奶风味鉴别图。

具体实施方式

如上所述，本发明提供了一种利用风味指纹图谱鉴定酸奶中的发酵剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供或制作饮用型酸奶；(2)利用顶空固相微萃取进行前处理，将得到的萃取物利用气相色谱一质谱联用测定饮用型酸奶样品的挥发性风味物质；(3)构建饮用型酸奶风味指纹图谱；(4)利用特征物质鉴定不同品牌发酵剂。

作为优选，步骤(1)饮用型酸奶的制作中，制作方法为：先将原料乳进行预热，然后牛奶、蔗糖、稳定剂混溶后进行均质，随后采用高温巴氏灭菌，灭菌条件为90-95℃，3-5分钟。在无菌操作条件下添加一定量的发酵剂，充分搅拌均匀后，42℃培养5-7h。发酵结束后进行后均质，再将酸奶置于3～4℃冰箱中进行后熟10-12h，即为成品。

作为优选，步骤(2)利用顶空固相微萃取进行前处理，将得到的萃取物利用气相色谱一质谱联用测定饮用型酸奶样品的挥发性风味物质中，顶空固相微萃取包括以下步骤：对固相微萃取装置的萃取头进行老化处理，具体为将萃取头插入气相色谱进样口中，260℃下老化30min，准确称取酸奶样品5ml移入15ml顶空瓶内，在磁力搅拌器上混匀后45℃下加热10min，以达到体系的气液平衡状态向顶空瓶中插入固相微萃取装置的萃取头，推出纤维头后吸附45min。

作为优选，步骤(2)中的色谱质谱条件为：仪器型号：岛津qp-2010气相色谱一质谱联用仪；色谱柱一db-wax石英毛细管柱；升温程序：起始温度为30-40℃，保持2-3min，以5-6℃/min升温到180℃-200℃，保持1min，7-10℃/min升温到230-250℃，保持5-7min；进样口温度：250℃；传输线：230℃；载气：氦气；流速0.8-3.0ml/min；进样方式：不分流进样；电离方式：ei；电子能量：70ev；离子源温度：200-220℃；接口温度：200-220℃；溶剂延迟时间：1.5-3min；按上述色谱质谱条件测得10种酸奶样品的风味物质。

作为优选，步骤(3)饮用型酸奶风味指纹图谱构建中，10个不同酸奶样品按照步骤(1)步骤(2)进行制作和处理，对酸奶中的风味成分进行定性定量分析，得到色谱图。求出色谱图中其他挥发性化合物的相对峰面积和相对保留时间，最后选择相对峰面积sr>1％的色谱峰作为样品的特征峰，从中筛选出15个共有峰作为指纹图谱的特征峰，这15个共有峰依次为乙醛、双乙酰、2-庚酮、乙偶姻、2-壬酮、壬醛、乙酸、2-乙基己醇、癸醛、正辛醇、丁酸、己酸、辛酸、己二酸二辛酯。

作为优选，选择乙酸作为饮用型酸奶风味指纹图谱参照物。饮用型酸奶风味指纹图谱相似度计算和评价是运用excel对指纹图谱的相似度进行计算。饮用型酸奶特征风味指纹图谱的应用是运用origin9.0对数据进行处理，利用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌发酵的饮用型酸奶能够很好的与其它菌种发酵的酸奶相区分。

作为优选，其特征在于，步骤(4)利用特征物质鉴定不同品牌发酵剂中，10个不同酸奶样品按照步骤(1)步骤(2)进行制作和处理，对酸奶中的风味成分进行定性定量分析，找出各个品牌单独共有的物质作为特征物质。科汉森品牌发酵剂酸奶单独共有的风味物质为1-壬醇，丹尼斯克品牌发酵剂酸奶单独共有的风味物质为2-羟基异丁酸甲酯、正己醇。多爱特品牌发酵剂酸奶单独共有的风味物质为1-戊醇、甲基庚烯酮、乳酸异丁酯、异丁酸、丁位辛内酯。利用这些特征物质能够对不同品牌进行区分鉴定。

以下将结合具体的实施方式来对本次发明进行进一步解释：

(1)样品的收集和制作

本发明共收集10种用型号、品牌各不相同含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的直投发酵剂，包括科汉森903、科汉森904、科汉森mild1.0、丹尼斯克863、丹尼斯克505、丹尼斯克883、多爱特jointecd、多爱特vh394、多爱特jointecy14、多爱特jointecy14。饮用型酸奶的制作中，制作方法为：先将原料乳进行预热，然后牛奶、蔗糖、稳定剂混溶后进行均质，随后采用高温巴氏灭菌，灭菌条件为90-95℃，3-5分钟。在无菌操作条件下添加一定量的发酵剂，充分搅拌均匀后，42℃培养5-7h。发酵结束后进行后均质，再将酸奶置于3～4℃冰箱中进行后熟10-12h，即为成品，10种不同发酵剂的酸奶样品用于风味测定。

(2)样品挥发性风味物质的测定

利用顶空固相微萃取进行前处理，将得到的萃取物利用气相色谱一质谱联用测定饮用型酸奶样品的挥发性风味物质，顶空固相微萃取包括以下步骤：对固相微萃取装置的萃取头进行老化处理，具体为将萃取头插入气相色谱进样口中，260℃下老化30min，准确称取酸奶样品5ml移入15ml顶空瓶内，在磁力搅拌器上混匀后，45℃下加热10min，以达到体系的气液平衡状态向顶空瓶中插入固相微萃取装置的萃取头，推出纤维头后吸附45min。气相色谱一质谱联用条件为：仪器型号：岛津qp-2010气相色谱一质谱联用仪；色谱柱一db-wax石英毛细管柱；升温程序：起始温度为30-40℃，保持2-3min，以5-6℃/min升温到180℃-200℃，保持1min，7-10℃/min升温到230-250℃，保持5-7min；进样口温度：250℃；传输线：230℃；载气：氦气；流速0.8-3.0ml/min；不分流进样。进样方式：不分流进样；电离方式：ei；电子能量：70ev；离子源温度：200-220℃；接口温度：200-220℃；溶剂延迟时间：1.5-3min；按上述色谱质谱条件测得10种酸奶样品的风味物质。

(3)饮用型酸奶特征风味指纹图谱构建

a.指纹图谱方法学验证

精密度试验

取样品汉森903发酵剂，按照步骤(1)制作酸奶，选定的气质条件步骤(2)连续进样5次，记录色谱峰的保留时间和峰面积，并计算相对标准偏差(rsd)值，用于考察仪器的精密度。主要共有峰的相对保留时间均小于0.3％，相对峰面积均小于3％，说明仪器的精密度良好，符合指纹图谱的要求。

重复性试验

按照步骤(1)平行制备5组样品待测液，分别按选定的气质条件步骤(2)进样，同样进行记录，计算rsd值，用于考察样品的重复性。主要共有峰的相对保留时间均小于0.3％，相对峰面积均小于6％，说明仪器的精密度良好，符合指纹图谱的要求。

稳定性试验

按照步骤(1)制备样品，按选定的气质条件步骤(2)在0h、2h、4h、8h、12h、24h不同的时间进样，记录，并计算rsd值，用于考察样品及仪器的稳定性。主要共有峰的相对保留时间均小于0.3％，相对峰面积均小于3％，说明仪器的精密度良好，符合指纹图谱的要求。

表1.精密度试验、重复性试验、稳定性试验结果

从上表能够看出，精密度试验、重复性试验、稳定性试验结果均符合指纹图谱要求。

b.共有峰的筛选

10种样品按步骤(2)进行处理进样测定后得到各样品的图谱，最后从样品中选择相对峰面积sr>1％的色谱峰作为样品的特征峰，从中筛选出15个共有峰作为指纹图谱的特征峰，这15个共有峰依次为乙醛、双乙酰、2-庚酮、乙偶姻、2-壬酮、壬醛、乙酸、2-乙基己醇、癸醛、正辛醇、丁酸、己酸、辛酸、己二酸二辛酯。

c.参照物的选择

选择参考峰，其选择依据是该色谱峰在色谱图中靠近中心位置、且峰的强度较高、比较稳定、同时为所有样品中共有，以此峰作为参考峰。乙酸在色谱图中响应值最高且峰面积最大，与相邻风味成分分离较好。综合分析，本发明选取乙酸作为指纹图谱的参照物。

c.饮用型酸奶特征风味指纹图谱信息

表2.饮用型酸奶特征风味指纹图谱

由上表得知14种特征风味物质中，包括3种醛、4种酮、4种酸、2种醇及1种酯类。特征物质谱图如附图1所示。

d.指纹图谱相似度评价

向量夹角余弦法和相关系数法是评价指纹图谱相似度的重要方法，主要从各指纹峰间峰面积比例的相似性上进行评价，判断不同种酸奶各指纹峰相对含量的一致。为确保所构建指纹信息的可靠性，优先考虑构建样品指纹信息的相似度情况。对10种样品运用excel进行相似度计算，计算结果如下表所示。由表可见，10个酸奶样品通过向量夹角余弦法和相关系数法评价其相似度都大于0.90，说明用的样品与标准指纹图谱之间具有较好的相似性。

表3.10种样品相似度结果

e.饮用型酸奶特征风味指纹图谱的应用

本发明依据所构建的饮用型酸奶特征风味指纹信息数据表(1)分别对3种其他干酪菌种(干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种、嗜热链球菌)制作的酸奶(b1-b3)和10个同一菌种(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)不同型号酸奶样品(a1-a10)进行区分，采用oringe软件中的pca分析。如附图2所示，其中10个同一菌种不同型号酸奶样品和3种其他干酪菌种制作的酸奶聚集在不同位置，说明其间存在明显差异，完全可以进行区分。(4)利用特征物质鉴定不同品牌发酵剂

通过对10种不同发酵剂发酵酸奶风味的测定，筛选出各品牌单独共有的风味物质，作为其特征物质。科汉森品牌发酵剂酸奶单独共有的风味物质为1-壬醇，丹尼斯克品牌发酵剂酸奶单独共有的风味物质为2-羟基异丁酸甲酯、正己醇。多爱特品牌发酵剂酸奶单独共有的风味物质为1-戊醇、甲基庚烯酮、乳酸异丁酯、异丁酸、丁位辛内酯。利用这些特征物质能够对不同品牌进行区分鉴定。特征物质图谱如附图3所示。不同品牌发酵剂酸奶区分如附图4所示。

表4.不同品牌发酵剂酸奶特征风味物质

注：a1、a2、a3为科汉森品牌发酵剂酸奶；a4、a5、a6为丹尼斯克品牌发酵剂酸奶；a7、a8、a9、a10为多爱特品牌发酵剂酸奶。

本发明应用指纹图谱技术和指纹图谱相似度评价体系，构建了饮用型酸奶普通菌种特征风味的标准指纹图谱和指纹图谱应用的方法，该方法操作简便、准确可靠，可实现对不同菌种酸奶的有效鉴定，为酸奶菌种的判别验证技术提供技术支撑。同时通过筛选不同品牌的特征风味可对发酵剂品牌进行区分，防止假冒品牌的情况出现。