一种高效液相检测Fmoc-AEEA含量的方法与流程

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种一种高效液相检测fmoc-aeea含量的方法。

背景技术：

[2-[2-(fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸，化学结构式为：

；简称fmoc-aeea。

由于工艺原因，产物中通常包括fmoc-β-ala-aeea、aeea、fmoc-aeea-aeea和fmoc-β-ala等杂质，现有技术中，并无一种检测方法，以同时区分主成分fmoc-aeea和上述杂质，而从准确测定主成分fmoc-aeea的含量。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明公开一种高效液相检测fmoc-aeea含量的方法，其中包含的杂质为fmoc-β-ala-aeea、aeea、fmoc-aeea-aeea和fmoc-β-ala，本发明中，主成分的色谱峰与上述各杂质的色谱峰成功区分，从而准确测定处主成分fmoc-aeea的含量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效液相检测fmoc-aeea含量的方法，待测样品中主成分为fmoc-aeea，待测样品中还包括以下杂质：fmoc-β-ala-aeea、aeea、fmoc-aeea-aeea和fmoc-β-ala；采用外标法来检测主成分fmoc-aeea的含量；具体检测方法具体如下：

（1）色谱条件：色谱柱为agilentzorbaxsb-c18，检测波长为210-220nm，柱温为25℃；流动相a为0.1%tfa水；流动相b为0.1%tfa乙腈，流动相流速为0.8-1.2ml/min；

洗脱程序为：0-20min内，流动相a由70%降至0，流动相b由30%升至100%；在20-25min内，保持流动相a为0，流动相b为100%；在25-27min内，流动相a由0升至70%，流动相b由100%降至30%；在27-35min内，保持流动相a为70%，流动相b为30%；

（2）绘制标准曲线：以乙腈为溶剂，将fmoc-aeea标准品配置成不同浓度的试样，将不同浓度的标准品试样按照进行步骤（1）中的分析方法进行检测，得到不同浓度的主产品fmoc-aeea的峰对应的峰面积，绘制出标准曲线；

（3）配制待测样品溶液：以乙腈作为溶剂，将待测样品溶于乙腈中；

（4）将步骤（3）所得的待测样品溶液，按照步骤（1）中的分析方法进行检测，得到主产品fmoc-aeea的峰的峰面积，再将所得峰面积代入步骤（2）所得标准曲线，得到待测样品中主产品fmoc-aeea的含量。

进一步的，步骤（3）中，待测样品配制浓度为0.8-1.2mg/ml。

进一步的，进样量为5μl。

进一步的，检测波长为220nm。

进一步的，流动相的流速为1ml/min。

本发明还提供一种高效液相检测fmoc-aeea中有关物质含量的方法，所述有关物质包括fmoc-β-ala-aeea、aeea、fmoc-aeea-aeea和fmoc-β-ala，采用主成分自身对照法来检测各有关物质的含量；具体色谱条件：色谱柱为agilentzorbaxsb-c18，检测波长为210-220nm，柱温为25℃；流动相a为0.1%tfa水；流动相b为0.1%tfa乙腈，流动相流速为0.8-1.2ml/min；

洗脱程序为：0-20min内，流动相a由70%降至0，流动相b由30%升至100%；在20-25min内，保持流动相a为0，流动相b为100%；在25-27min内，流动相a由0升至70%，流动相b由100%降至30%；在27-35min内，保持流动相a为70%，流动相b为30%。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明中，涉及到需要分离的杂质包括：fmoc-β-ala-aeea、aeea、fmoc-aeea-aeea和fmoc-β-ala，尤其涉及到fmoc-β-ala与主产品fmoc-aeea的分离；本发明方法中，在流动相中加入tfa（三氟乙酸），可以有效改善峰形；由于本发明需要分离的杂质较多，且由于fmoc-β-ala与fmoc-aeea的极性很接近，通常情况下，此两者分离困难，为了在较短时间内分离所有杂质，尤其是分离fmoc-β-ala与fmoc-aeea，本发明采用梯度洗脱程序，且洗脱程序总时间为35min，所有杂质在此洗脱程序下，均可以有效分离。本发明方法测定主成分fmoc-aeea的含量，具有快速、准确的特点。

附图说明

图1为主成分出峰图；

图2为各杂质与主成分的定位图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

一种高效液相检测fmoc-aeea含量的方法，待测样品中主成分为fmoc-aeea，待测样品中还包括以下杂质：fmoc-β-ala-aeea、aeea、fmoc-aeea-aeea和fmoc-β-ala；采用外标法来检测主成分fmoc-aeea的含量；具体检测方法具体如下：

（1）色谱条件：色谱柱为agilentzorbaxsb-c18，检测波长为220nm，柱温为25℃；流动相a为0.1%tfa水；流动相b为0.1%tfa乙腈，流动相流速为1ml/min；进样量为5μl；

洗脱程序为：

（2）绘制标准曲线：取fmoc-aeea标准品适量，精密称定，加乙腈溶解分别制备浓度为0.2、0.6、1.0、1.4、1.6、2.0mg/ml的溶液，再按照上述步骤（1）中规定的色谱条件进行走样，记录色谱图；以fmoc-aeea的峰面积为纵坐标y，fmoc-aeea溶液的浓度为横坐标x，得到回归方程y＝11032x+527，r²＝0.9998，因此，fmoc-aeea在0.2～2.0mg/ml线性范围内良好；

（3）配制待测样品溶液：以乙腈作为溶剂，将待测样品溶于乙腈中，待测样品配制浓度约为1.0mg/ml；

（4）将步骤（3）所得的待测样品溶液，按照步骤（1）中的分析方法进行检测，得到主产品fmoc-aeea的峰的峰面积，再将所得峰面积代入步骤（2）所得标准曲线，得到待测样品中主产品fmoc-aeea的含量。

实施例2

重复性实验：取同一批待测样品fmoc-aeea，按照上述步骤（3）中的方法重复配制6份，并按照上述步骤（4）所述的方法进行含量测定，记录色谱图。结果见表1，在本色谱条件下6份的平均含量为99.72％，rsd(n＝6)为0.43％，结果表明该含量测定方法的重复性良好。

表1重复性实验结果

实施例3

准确度实验：精密称取fmoc-aeea待测样品约80mg、100mg和120mg各三份，分别置于100ml容量瓶中，分别加乙腈稀释至刻度，摇匀，制备成为浓度分别为80％、100％及120％的供试品溶液，另取fmoc-aeea标准品以相同方法制备对照品溶液，再按照上述步骤（1）所述的色谱条件进行进样，记录色谱图，根据对照品溶液的色谱数据做出标准曲线，由标准曲线算出测得量，结果见表2，在拟定的色谱条件下，三个浓度下的fmoc-aeea的回收率均在98.2％～99.7％之间，rsd值为0.44％，即本发明检测fmoc-aeea含量的方法具有良好的准确度。

表2准确度实验结果

实施例4

为了测定每种杂质的含量，基于上述检测方法，采用主成分自身对照法进行有关物质含量的检测：

（1）具体色谱条件：色谱柱为agilentzorbaxsb-c18，检测波长为220nm，柱温为25℃；流动相a为0.1%tfa水；流动相b为0.1%tfa乙腈，流动相流速为1ml/min；进样量为5μl；

洗脱程序为：

（2）待测样品溶液的制备：精密称定待测样品，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为待测样品溶液；

（3）对照溶液的制备：精密量取步骤（2）所得待测样品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作对照溶液；

（4）测定有关物质：按照步骤（1）中的色谱条件进行进样，记录色图谱，用主成分自身对照法测定，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍。