本发明涉及病毒检测
技术领域：
：，尤其涉及一种新型冠状病毒igm、igg和iga联合检测试剂盒以及检测方法。本申请要求2020年9月29日提交的美国专利(专利申请号为us17/036,042)的权益，在此将上述申请的内容引用并入本文。
背景技术：
：：人类感染sars-cov-2可能会导致严重的肺炎，并伴有大量炎性细胞因子的产生(“细胞因子风暴”)。与病毒有关的疾病具有典型的肺炎症状，并伴有其他一些症状，例如肌肉疼痛，头痛和喉咙痛等，通常被称为covid-19。目前，尚无针对covid-19感染的有效治疗方法。因此，预后很大程度上取决于宿主免疫系统的功效。已经开发出针对病毒特异性igm和igg抗体的早期诊断试剂盒，或检测病毒水平的qrt-pcr试剂盒，但某些患者血清中高水平的免疫球蛋白引起的假阳性结果的高百分比也已成为血清抗病毒免疫球蛋白(ig)检测的挑战。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种新型冠状病毒igm、igg和iga联合检测试剂盒以及检测方法，该联合检测试剂盒可检测sars-cov-2的人igg，iga和igm抗体的真实信号，采用该试剂盒检测的假阳性结果极低。其技术方案如下：本发明提供了一种新型冠状病毒igm、igg和iga的联合检测试剂盒，包括：包被有新型冠状病毒sars-cov-2抗原的珠子、包被有牛血清白蛋白的珠子和荧光素标记的抗体或其抗原的结合片段；所述sars-cov-2抗原为sars-cov-2的多肽或其片段；所述抗体为抗人igg抗体，抗人iga抗体和抗人igm抗体。所述珠子至少为两种荧光强度不同的珠子，珠子的荧光强度的不同使它们可以彼此分开。本发明提供的新型冠状病毒igm、igg和iga的联合检测试剂盒，该试剂盒引入包被有牛血清蛋白的珠子作为包被有所述新型冠状病毒sars-cov-2抗原的珠子的对照，通过比较两组珠子的荧光信号比率，可以确定sars-cov-2的人igg，iga和igm抗体的真实信号。采用该试剂盒检测sars-cov-2的假阳性率极低。本发明试剂盒中，所述sars-cov-2的蛋白或其片段为sars-cov-2刺突蛋白或其片段以及sars-cov-2核衣壳蛋白或其片段中的至少一种，优选为sars-cov-2刺突蛋白或其片段。sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的氨基酸序列如seqidno：1所示(genbank登录号：qhd43416)，其中，氨基酸v16-q690是减去前导序列的序列。sars-cov-2刺突蛋白或其片段优选包含受体结合结构域(rbd)的片段，例如：包括但不限于seqidno：1氨基酸r319-f541(seqidno：2)或之具有亲和力的抗原性片段，并与抗sars-cov-2特异性抗体结合的片段。可通过本领域技术人员熟知的方法获得sars-cov-2抗体的抗原片段seqidno：2，并确认其与抗sars-cov-2抗体结合。本发明中，还可以使用刺突蛋白区域2(氨基酸m697-p1213(seqidno：3)或其抗原片段，或sars-cov-2衍生的核衣壳蛋白的氨基酸m1-a419(seqidno：4(accessionno：qhd43423))或其抗原片段来进一步调整。本发明试剂盒中，所述珠子优选为荧光强度不同且尺寸不同的珠子，更优选地，所述珠子根据尺寸大小分为大珠子、中珠子和小珠子，且所有珠子的荧光强度不同，使得每个珠子具有不同ssc和fsc特性，便于在流式细胞中予以区分。本发明中，所述珠子可以为蓝色荧光珠或红色荧光珠，本发明实施例中，所述珠子带raybrightred647染料。本发明中，珠子的材料为聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚苯乙烯、乳胶、聚脂族醇、聚(乙烯基)聚合物、聚丙烯酸、聚有机酸、聚氨基酸、共聚物、嵌段共聚物、三元共聚物、聚醚、天然聚合物、聚酰亚胺、表面活性剂、聚酯、支链聚合物、环聚合物和多醛中的一种或两种以上。更具体地，珠子的材料为溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、5聚丙烯腈、聚酰胺、聚丙烯酰胺、丙烯醛、聚丁二烯、聚己内酯、聚酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚二甲基硅氧烷、聚异戊二烯、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苄基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯。优选聚乳酸、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)、聚酸酐、聚氧乙烯酯、10-聚磷腈、聚磷酸或其组合。组成聚合物粒子的代表性聚合物包括例如聚(苯乙烯-共乙烯基苄基氯-共丙烯酸)(摩尔比为85：10：5)，聚(苯乙烯-共丙烯酸酸)(摩尔比为99：1)，聚(苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物)(90:10摩尔比)，聚(苯乙烯-丙烯酸-共聚物-间-对-二乙烯基苯)(摩尔比：89：10：1)，聚(苯乙烯-co-2-羧乙基15丙烯酸酯)(摩尔比为90:10)，聚(甲基丙烯酸甲酯-共丙烯酸)(摩尔比为70:30)和聚(苯乙烯-丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸)(重量比为45:45:10)。大多数由合成聚合物(如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯或乳胶)形成的珠子可以从商业上获得(如bio-radlaboratories(里士满，加利福尼亚州)和lkbprodukter(瑞典斯德哥尔摩)。由琼脂糖、交联琼脂糖、球蛋白、脱氧核糖核酸和脂质体等颗粒组成的珠子可从bio-radlaboratories，pharmacia(新泽西州皮斯卡塔维)和ibf(法国)购得。聚丙烯酰胺和琼脂糖共聚物形成的珠子可从ibf和pharmacia等处购买。本发明提供的包被有covid-19特异性抗原的荧光珠来源于美国佐治亚州peachtreecorners的raybiotechinc.)本发明可以根据测试样本量的需求来确定珠子的珠子的种类，可以随着测试样本的增加来增加珠子的种类。本发明提供的试剂盒中，珠子的种类优选为25种，分为大珠子、中珠子和小珠子，如表1所示，珠子idr1-r7为大珠子，珠子idr8-r17为中等珠子，珠子idr18-r25为小珠子。本发明中，r1-r25珠子与sars-cov-2刺突蛋白或其片段或牛血清白蛋白(bsa)缀合。因此，本发明每个试剂盒都提供了25组与sars-cov-2刺突蛋白和25组与bsa缀合的珠子。表1本发明试剂盒中，荧光素标记的抗体或其抗原的结合片段中，所述荧光素选自异硫氰酸荧光素(fitc，绿色)，cy2，cy3，cy3.5，cy5，cy5.5，cy7，cy7.5，texasred，alexafluor，hilytetmfluor，dylitetmfluor，raybright.rtmv450，raybright.rtmb488和红色荧光蛋白，其中，红色荧光蛋白为r-藻红蛋白。优选地，raybright.rtmv450标记抗人igg抗体，raybright.rtmb488标记抗人iga抗体，r-pe标记抗人igm抗体；所述抗体为所述抗人igg抗体，抗人iga抗体和抗人igm抗体，优选为抗人iggfc段抗体，抗人igafc段抗体和抗人igmfc段抗体。本发明试剂盒中，还包括洗涤缓冲液和分析稀释液。所述洗涤缓冲液为含0.1％吐温-20的pbs溶液；所述分析稀释液用于稀释待测样品，所述分析稀释液为pbs溶液。本发明试剂盒中，还包括：v形96孔板。本发明还提供了一种联合检测生物样本中新型冠状病毒igm、igg和iga的方法，包括以下步骤：步骤1：将上述联合检测试剂盒中的每一个包被有所述新型冠状病毒sars-cov-2抗原的珠子与待测样品进行孵育；步骤2：将每一个包被有所述牛血清白蛋白的珠子分别与待测样品进行孵育；步骤3：合并步骤1和步骤2所述孵育后的珠子，加入荧光素标记的抗体或其抗原的结合片段进行孵育，获得的偶联物分别记为抗原珠和对照珠；步骤4：分别测定每种抗原珠和每种对照珠的表面每种荧光素的荧光强度，并计算其平均荧光强度，再计算同种抗原珠和对照珠平均荧光强度的比率；当一种所述抗原珠表面一种荧光素的荧光强度≥200，且所述比率≥1.5时，判断所述待测样品中存在sars-cov-2；当一种所述抗原珠表面一种荧光素的荧光＜200，且所述比率≤1时，判断所述待测样品中不存在sars-cov-2。本发明提供的联合检测生物样本中新型冠状病毒igm、igg和iga的方法的原理如图1所示，将珠子分别与sars-cov-2s1抗原和牛血清白蛋白(bsa)偶联，(抗原与珠子偶联，不与bsa偶联)并与含有抗sars-cov-2病毒的igm，igg或iga抗体的样品一起孵育，然后与荧光素偶联的山羊抗人igm，igg和iga二抗进行染色。在多色流式细胞仪上分析抗病毒免疫球蛋白的水平。本发明步骤1中，每一个珠子位于一个单独体积的容器中，所述容器优选为v形96孔板；所述待测样品为疑似已暴露于sars-cov-2病毒的受试者的血清或血浆与抗病毒剂孵育后的样品；所述抗病毒剂为beta-丙内脂(bpl)；步骤1具体为：将包被有所述新型冠状病毒sars-cov-2的珠子加入96孔板中，每一个珠子位于一个单独的孔中，再加入待测样品稀释液进行孵育，采用洗涤缓冲液洗涤珠子，离心去除上清液，获得的珠子表面偶联有sars-cov-2特异性igm、igg和iga中的至少一种。步骤2具体为：将包被有牛血清白蛋白的珠子加入96孔板中，每一个珠子位于一个单独的孔中，再加入待测样品进行孵育，采用洗涤缓冲液洗涤珠子，离心去除上清液，获得的珠子表面偶联有sars-cov-2特异性igm、igg和iga中的至少一种。步骤1和步骤2中使用的相同大小的珠子位于同一96孔板中；每个孔中加入25μl待测样品稀释液；所述孵育优选在室温下在轨道振荡器上以1000rpm将板振荡90分钟；所述离心优选为1000g离心5分钟。步骤3中，所述合并步骤1和步骤2孵育后的珠子具体为：将步骤1和步骤2孵育后的珠子采用洗涤缓冲液进行洗涤后，再加入洗涤缓冲液将不同种类的抗原珠进行合并，将不同种类的对照珠进行合并，例如：96孔板每块96孔板中48个抗原珠样品和48个对照珠样品，共25块96孔板，合并抗原珠时，将r1-s～r25-s第一个孔的样品进行合并，合并成含有25个抗原珠的混合液。按照前述方法依次对48个抗原珠样品、48个对照珠样品进行合并。合并后优选在室温下在1000g下旋转5分钟除上清液；接着在加入荧光素标记的抗体或其抗原的结合片段进行孵育，获得的偶联物分别记为抗原珠和对照珠；所述孵育优选在室温下在轨道振荡器上以1000rpm孵育30分钟。步骤4中采用流式细胞仪测试荧光强度；由于抗人igg抗体，抗人iga抗体和抗人igm抗体偶联的荧光素不同，因此，需要收集抗原珠和对照珠产生的每一种荧光，并计算出每种荧光的平均荧光强度，确定抗原珠的平均荧光强度与对照珠的平均荧光强度的比率，例如：取步骤3合并的48组抗原珠，每组25个抗原珠(r1-s～r25-s)，采用流式细胞仪测定出48组抗原珠的荧光强度。步骤3合并的48组对照珠中25种抗原珠(r1-ctl～r25-ctl)的计算方法相同。再通过荧光强度计算出抗原珠(例如：r1-s，igm)平均荧光强度与对照珠(例如：r1-ctl，igm)平均荧光强度的比率(mfi)。本发明提供的试剂盒采用上述检测方法可以在2小时内测试1200个样品。本发明待测样品阳性/阴性判断具体为：当一种所述抗原珠表面一种荧光素的平均荧光强度≥200，且所述比率≥1.5时，判断所述待测样品中存在sars-cov-2。例如：当r1-s表面r-pe的平均荧光强度≥200，且比率≥1.5时，判断所述待测样品中存在sars-cov-2。当一种所述抗原珠表面一种荧光素的平均荧光＜200，且所述比率≤1时，判断所述待测样品中不存在sars-cov-2。例如：当r1-s表面r-pe的平均荧光＜200，且所述比率≤1时，判断所述待测样品中不存在sars-cov-2。通过上述方法计算得到的mfi可以确定与sars-cov-2抗原诱导的特异性人igg，iga和igm的相对水平，进而确定待测样品对sars-cov-2感染的免疫应答。本发明中，所述待测样品为血清或血浆。从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：本发明提供了一种新型冠状病毒igm、igg和iga的联合检测试剂盒，该试剂盒以包被有所述新型冠状病毒sars-cov-2的多肽或其片段的珠子作为抗原珠，引入包被有牛血清蛋白的珠子作为包被有所述新型冠状病毒sars-cov-2抗原的珠子的对照，通过比较抗原珠与对照珠的荧光信号比率，可以确定sars-cov-2的人igg，iga和igm抗体的真实信号。采用该试剂盒检测sars-cov-2的假阳性率极低，特异性好，灵敏度高。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1为本发明提供的人sars-cov-2特异性igg，iga和igm的高通量流式细胞术的分析示意图；图2为本发明实施例3提供的抗原珠和对照珠在96孔板的分布图；图3为本发明实施例3提供的r1～r25细胞流式图，其中横坐标为fsc，纵坐标为ssc(fsc前向散身光反映细胞的大小，ssc侧向散身光反映细胞的形状)；图4为本发明实施例3提供的r1～r25的细胞流式图，其中，横坐标为raybrightred647，纵坐标为ssc；图5为本发明实施例3提供的结合二抗的r1～r14的细胞流式图；图6为本发明实施例3提供的结合二抗的r1～r25细胞流式图；图7a为本发明实施例3提供的r1-s～r13-s的细胞流式图；图7b为本发明实施例3提供的r1-ctl～r13-ctl的细胞流式图。具体实施方式为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例中使用的试剂均为市购。实施例1本实施例的新型冠状病毒igm、igg和iga的联合检测试剂盒含有以下组分：包被有病毒蛋白的多重珠子(r1-s至r25-s)、包被有bsa的多重珠(r1-ctl至r25-ctl)、5×分析稀释液、20×洗涤缓冲液、96孔微孔板、raybright.rtmv450标记的山羊抗人igg(fc)、raybright.rtmb488标记的山羊抗人iga(fc)和r-pe标记的山羊抗人igm(fc)。试剂盒的组分如下：1、包被有病毒蛋白的多重珠子(r1-s至r25-s)2、包被有bsa的多重珠(r1-ctl至r25-ctl)3、5×分析稀释液(pbs溶液)4、20×洗涤缓冲液(包含0.1％吐温-20的pbs溶液)5、raybright.rtmv450标记的山羊抗人igg(fc)、raybright.rtmb488标记的山羊抗人iga(fc)和r-pe标记的山羊抗人igm(fc)。实施例2本实施例为联合检测生物样本中新型冠状病毒igm、igg和iga的方法的具体实施例1、试剂的制备所有试剂均置于冰上。使用前，多种珠子的混合液必须每次旋转30秒，以确保珠状悬浮。使用25μl珠子/测试。荧光珠子应避免频繁暴露于光下。用去离子水稀释5×分析稀释液，制成1×分析稀释液。将raybright.rtmv450标记的山羊抗人igg，raybright.rtmb488标记的山羊抗人iga和r-pe标记的山羊抗人igm以1：100进行稀释作为工作液。使用50微升/测试。用去离子水稀释20×洗涤缓冲液，制成1×洗涤缓冲液，稀释量仅需满足试验所需的量。2、样品的制备1μl原始患者血清，以1×分析稀释液按1：8000的比例稀释，一次最多可使用25个孔板(25组抗原珠/对照珠)。如图2所示，每个96孔板使用一种珠子(总共25个孔板，每个孔板取r1-r25共25组珠子中的一个)。在96孔圆形底板)中进行两步稀释，然后将这些样品转移到测试板(v形96孔板)上。每个测试板可以测试25个样品，将25个板(25组珠子)以96孔板的形式合并，可以测试1200个样品。3、测定程序(1)最多准备25个v形96孔微孔板，并标记样品位置。将每个样品与抗原珠和对照珠在两个单独的孔中孵育。如图2所示，孔板的上部的48个孔(96孔板的a-d行)可用于抗原珠测试，而下部的48个孔(e-h行)用于对照珠。(2)将25μl抗原珠或对照珠添加到相应的孔中。使用多通道移液器将25μl预稀释样品从96孔圆形底板转移到v形测试板中的相应孔中(每个孔的总体积为50μl)。在室温下置于轨道振荡器上以1000rpm将板振荡90分钟。(3)通过添加200μl洗涤缓冲液洗涤珠子，并在室温下以1000g离心5分钟，然后使用多通道移液器除去上清液。(4)使用多通道移液器将200μl洗涤缓冲液中25块板中相应孔的珠子合并至组合板(v形96孔板)中。组合板中共25个珠子(r1-s至r25-s或r1-ctl至r25-ctl)，将其在室温下以1000g的速度离心5分钟。然后除去上清液。(5)取50μl抗体工作液(raybright.rtmv450标记的山羊抗人iga，raybright.rtmb488标记的山羊抗人iga和r-pe标记的山羊抗人igm)滴加到每个孔中，于室温下在轨道振荡器上以1000rpm孵育30分钟。(6)同步骤4将组合板洗涤一次，然后将抗原珠和对照珠重悬于200μl分析稀释液中，然后转移至具有高通量系统的流式细胞仪中，或将样品转移至标准facs管中以手动读取。实施例3本实施例可以使用两种颜色的珠：“红色珠”(在apc通道或raybright.rtm647通道中的发射)或“蓝色珠”(紫色450nm通道)。本实施例优选使用蓝色珠，标记为r1-r25。三种荧光染料(raybright.rtmv450，raybright.rtmb488和r-pe被用于同时检测igm，iga和igg，因此，本实施例使用一个具有紫色激光，蓝色激光和红色激光的多色流式细胞仪，在设置过程中进行细胞仪的标准质量控制和优化。首次使用流式细胞仪时需要进行补偿，如果apc通道中的珠子太密集，可能会有微笑的效果。发生这种情况时，需要手动调整raybrightrtmv450，raybright.rtmb488和r-pe对apc补偿以进行校正。如果使用校准颗粒(彩虹珠)对仪器进行标准化，则可以重新使用补偿矩阵。根据流式细胞仪的型号，可能需要启动采集软件并运行质量控制珠，然后再继续操作。raybright.rtmv450(相当于太平洋蓝或bv421)，raybright.rtmb488(相当于fitc)，r-pe和apc(raybright.rtm647)通道将进行新的检测。调整了fsc(正向散射，线性模式)和ssc(侧向散射，线性模式)的电压，以使主要珠子分群如3和图4所示，图3显示出了25种珠子的尺寸分布，图4为“单个珠子”创建fsc-h/fsc-a子分群，图4按大小和珠子的荧光强度分列出25种珠子，25种珠子均可以与sars-cov-2刺突蛋白和bsa缀合。如图5和图6所示，”从“单个珠子”(p1)父门以及大，中和/或小珠子上的门创建一个新的点图(从大，中和/或小珠子父门创建新的点图。基于ssc(线性模式)和apc(对数模式)分析所有珠子分群的门分群(大珠子，p2：中珠子，p3：小珠子，p4：))。调整电压，使所有分群均匀地分布在一个显著的区域(图5和6)。点图创建使用raybright.rtmv450，raybright.rtmb488和r-pe作为y轴，使用apc作为x轴(两个轴均使用对数刻度)，分别来自大，中和小珠子母分群。运行少量的阴性珠样品(抗原珠子或对照珠子仅在第一步用分析稀释液孵育)。调整raybrightrtmv450，raybrightrtmb488和r-pe电压，以便对于每个群体的阴性珠子，每个通道的mfi约为101-102。使用校准珠和与上述4种荧光染料偶联的任何相容抗体对4种颜色进行标准补偿。可能有必要针对apc通道手动调整raybright.rtmv450，raybright.rtmb488和r-pe的补偿，以在最右边显示珠子的信号，因为多重珠子携带不同强度的apc荧光。运行样品(如图5～7所示)。图7a和7b显示出了13种sars-cov-2患者血清样品的测试样品图。孵育后，将13个抗原珠或13个对照珠合并在一起，并与raybright.rtmv450标记的抗人igg，raybright.rtmb488标记的抗人iga和r-pe标记的抗人igm一起孵育。通过facs在藻红蛋白(r-pe)和别藻蓝蛋白(apc)通道上分析混合的珠。为了使每个测定的测试结果保持一致，如果在收集样品之前在每个测定中进行测试，则使用彩虹校准颗粒(彩虹珠，优选中档)可使测定标准化。获取数据后，将整个数据集导出为fcs文件，并以excel格式导出具有抗原珠或对照珠的所有孔的所有分群(r1-r25)的raybright.rtmv450，raybright.rtmb488和r-pe的mfi。数据分析打开flowjo并将fcs文件或包含fcs文件的文件夹拖到新的工作区。示例“p1”文件夹包含25个抗原珠测定的测试和25个对照珠测定和相应25个血清样品的测试。使用新名称将分析另存为wsp文件。选择样品p1_s1(25种抗原珠涂有sars-cov-2s1蛋白)，通过fsc-h/fsc-a创建“单个珠子”门。从“单个珠子”分群中，选择“大，中，小珠子”。在“大，中，小珠子”父门中，使用apc(log)使用ssc(线性)创建每个目标珠子分群调整轴设置以允许分离目标分群。如图5所示，为每个分群添加raybright.rtmv450，raybright.rtmb488和r-pe通道的“中值”(mfi)统计信息。将“中值”(raybright.rtmv450的mfi，raybright.rtmb488和r-pe)分群复制到所有目标组(r1-r25)。单击红色表格中所示的“表格编辑器”以打开表格。创建三个表，表-igg，表-iga和表-igm。对于table-igg，将表示每个群体(r1-r25)的raybright.rtmv450中位数的图标拖到表中。进行相同的table-iga(raybright.rtmb488)和tableigm(r-pe)导出所有分群的igg的mfi数据，选择表格顶部的“组”菜单，然后选择“p1”组。在“输出目标”菜单中，选择“至文件”。在“输出格式”菜单中，选择“excel”。在“输出目标”菜单中，选择一个保存文件的位置。单击“创建表”图标以导出excel表。对表iga和表igm重复上述步骤。用sars-cov-2抗原s1包被珠子，获得抗原珠(r1-s-r25-s)，用对照蛋白(bsa)包被珠子，获得对照珠(r1-ctl-r25-ctl)。对偶联物进行了优化，抗原珠(例如r1-s)及其对应的对照珠(例如r1-ctl)与正常的人血清孵育后，再与人igg，iga和igm的荧光染料偶联的二抗孵育，使抗原珠与对照珠具有类似的raybright.rtmv450，raybright.rtmb488和r-pe非特异性信号。使用抗原珠与对照珠的raybright.rtmv450，raybright.rtmb488和r-pe的mfi之比来确定血清样品中抗病毒igg，iga或igm阳性。如表2～3所示，表2显示了抗原珠和对照珠之间每个样本的raybright.rtmv450抗人igg，raybright.rtmb488抗人iga和r-pe抗人igm的mfi。表3显示了抗原珠和对照珠之间每个样本的raybright.rtmv450抗人igg，raybright.rtmb488抗人iga和r-pe抗人igm的mfi之比。任何大于等于1.5的比率都被诊断为阳性，而任何小于等于1的比率都被诊断为阴性。表4为在同一板中以4次重复分析的代表性阳性样品，显示抗原珠和对照珠的igm，igg和iga的平均荧光强度(mfi)读数的板内变异系数(cv)，以及抗原珠和对照珠平均荧光强度比率。表5为在同一板中重复分析4次的代表性阳性样品，显示抗原珠和对照珠的igm，igg和iga的平均荧光强度(mfi)读数的板内变异系数(cv)，以及抗原珠和对照珠平均荧光强度比率。表2表3表4表5试剂盒灵敏度和特异性分析表6显示了基于mfi比率的测定的灵敏性和特异性。a.阳性样品的临界值由mfi比率等于或大于1.5和s1抗原珠mfi读数超过200确定。b.灵敏度计算为真阳性/(真阳性+假阴性)；特异性计算为真阴性/(真阴性+假阳性)。表6ratiocutoffused：1.5mficutoffused200totalpatientsamples：121totalnormalsamples：299falsenegative：2falsepositive：2sensitivity：97.5％specificity：99.3％以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。序列表<110>瑞博奥（广州）生物科技股份有限公司<120>一种新型冠状病毒igm、igg和iga联合检测试剂盒以及检测方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1273<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metprovalproleuvalleuleuproleuvalserserglycysval151015alaleuthrthralathrglyleuproproalathrthralaserpro202530thralaglyvalthrthrproalaleuvalproalaserservalleu354045hisserthrglyalaleuproleuproproproseralavalthrthr505560prohisalailehisvalserglythralaglythrleualaproala65707580alaprovalleuproproalaalaglyvalthrproalaserthrgly859095leuseralaileilealaglythrileproglythrthrleualaser100105110leuthrglyserleuleuilevalalaalaalathralavalvalile115120125leuvalcysglyproglyprocysalaalaproproleuglyvalthr130135140thrhisleualaalaleuserthrmetglyserglyproalavalthr145150155160serseralaalaalacysthrproglythrvalserglyproproleu165170175metalaleuglyglyleuglyglyalaproleualaleualaglypro180185190valproleualailealaglythrproleuilethrserleuhisthr195200205proilealaleuvalalaalaleuproglyglyproseralaleugly210215220proleuvalalaleuproileglyilealailethralaproglythr225230235240leuleualaleuhisalaserthrleuthrproglyalaserserser245250255glythrthralaglyalaalaalathrthrvalglythrleuglypro260265270alathrproleuleuleuthralaglyalaglythrilethralaala275280285valalacysalaleualaproleuserglythrleucysthrleuleu290295300serprothrvalglyleuglyilethrglythrseralaproalaval305310315320glyprothrglyserilevalalaproproalailethralaleucys325330335proproglyglyvalproalaalathralaproalaservalthrala340345350thralaalaleualaileseralacysvalalaalathrservalleu355360365thralaseralaserproserthrproleucysthrglyvalserpro370375380thrleuleualaalaleucysprothralavalthralaalaserpro385390395400valilealaglyalaglyvalalaglyilealaproglyglythrgly405410415leuilealaalathralathrleuleuproalaalaprothrglycys420425430valilealathralaseralaalaleualaserleuvalglyglyala435440445thralathrleuthralaleuproalaleuseralaleuleupropro450455460glyalaalaileserthrglyilethrglyalaglyserthrprocys465470475480alaglyvalglyglyproalacysthrproproleuglyserthrgly485490495proglyprothralaglyvalglythrglyprothralavalvalval500505510leuserproglyleuleuhisalaproalathrvalcysglyproleu515520525leuserthralaleuvalleualaleucysvalalaproalaproala530535540glyleuthrglythrglyvalleuthrglyseralaleuleuproleu545550555560proproglyglyproglyalaalailealaalathrthralaalaval565570575alaalaproglythrleuglyileleualailethrprocysserpro580585590glyglyvalservalilethrproglythralathrseralaglyval595600605alavalleuthrglyalavalalacysthrglyvalprovalalaile610615620hisalaalaglyleuthrprothrthralavalthrserthrglyser625630635640alavalproglythralaalaglycysleuileglyalaglyhisval645650655alaalaserthrglycysalaileproileglyalaglyilecysala660665670serthrglythrglythralaserproalaalaalaalaservalala675680685serglyserileilealathrthrmetserleuglyalaglyalaser690695700valalathrseralaalaserilealaileprothralaprothrile705710715720servalthrthrglyileleuprovalsermetthrleuthrserval725730735alacysthrmetthrilecysglyalaserthrglycysseralaleu740745750leuleuglythrglyserprocysthrglyleualaalaalaleuthr755760765glyilealavalglyglyalaleualathrglyglyvalproalagly770775780valleuglyilethrleuthrproproileleualaproglyglypro785790795800alaproserglyileleuproalaproserleuproserleualaser805810815proileglyalaleuleuproalaleuvalthrleualaalaalagly820825830proileleuglythrglyalacysleuglyalailealaalaalaala835840845leuilecysalaglyleuproalaglyleuthrvalleuproproleu850855860leuthralaglymetilealaglythrthrseralaleuleualagly865870875880thrilethrserglythrthrproglyalaglyalaalaleuglyile885890895proproalametglymetalathralaproalaglyileglyvalthr900905910glyalavalleuthrglyalaglyleuleuilealaalaglyproala915920925seralaileglyleuileglyalaserleuserserthralaserala930935940leuglyleuleuglyalavalvalalaglyalaalaglyalaleuala945950955960thrleuvalleuglyleuserseralaproglyalaileserserval965970975leualaalaileleuseralaleualaleuvalglyalaglyvalgly980985990ilealaalaleuilethrglyalaleuglyserleuglythrthrval99510001005thrglyglyleuilealaalaalaglyilealaalaseralaalaleu101010151020alaalathrleumetserglycysvalleuglyglyserleualaval1025103010351040alaprocysglyleuglythrhisleumetserproproglyserala104510501055prohisglyvalvalproleuhisvalthrthrvalproalaglygly106010651070leualaprothrthralaproalailecyshisalaglyleualahis107510801085proproalaglyglyvalprovalseralaglythrhisthrproval109010951100thrglyalaalaprothrglyproglyileilethrthralaalathr1105111011151120provalserglyalacysalavalvalileglyilevalalaalathr112511301135valthralaproleuglyproglyleualaserproleuglyglyleu114011451150alaleuthrproleualahisthrserproalavalalaleuglyala115511601165ileserglyilealaalaservalvalalaileglyleuglyileala117011751180alaleualaglyvalalaleualaleualaglyserleuilealaleu1185119011951200glyglyleuglyleuthrglyglythrileleuthrpr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