一种3D细胞微球石蜡切片方法与流程

一种3d细胞微球石蜡切片方法
技术领域
1.本发明涉及一种石蜡切片方法，具体涉及到一种3d细胞微球石蜡切片方法。


背景技术：

2.与2d细胞培养相比，3d细胞培养能为细胞提供更加接近体内生存条件的微环境，更好地模拟生理状态，从而获得与体内实验更加一致的实验结果。随着一些新的3d细胞培养技术在生物相关性、使用便利性和通量上的改进，3d细胞培养在基础研究和药物发现中的应用越来越广泛。细胞微球体是一种简单的体外3d细胞培养模型，常见的包括胚胎小体、乳腺球、肿瘤球、肝细胞球、神经球等。相比更复杂的3d模型，细胞微球更容易实现均一大小的大规模生产，可以通过光学、荧光、共聚焦显微镜或高内涵系统等进行成像分析，因而也更适用于体外高通量药物筛选应用。但由于厚度的限制，使用光学和荧光等成像技术很难直接观察3d细胞微球内部的特征。虽然采用共聚焦成像技术能够解决观察内部特征的问题，但共聚焦显微镜十分昂贵，而且通常需要借助荧光染料，也不便于观察内部细胞的形态学特征，且其样本不宜长期保存，不利于后续分析。石蜡切片方法由于操作简单、价格低廉、可连续制片等特点，一直是观察细胞组织的形态结构及其动态变化的理想生物学研究技术。石蜡切片制作过程包括：固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、透明以及封片等步骤，在生物学的许多领域都得到了广泛的应用。
3.对细胞微球切片后染色可有效地获取细胞微球内部的形态学信息。细胞球石蜡切片常用的琼脂糖包埋法，受琼脂糖浓度、熔融状态的影响可能会发生浸蜡不充分，不易切片。因此，寻找一种适合于3d细胞微球的、简便的生物显微制片技术，用来完善和丰富获取3d细胞微球内部特征的技术手段显得非常重要。


技术实现要素：

4.本发明找到了一种适用于直径大约50～1000μm的3d细胞微球的石蜡切片方法，适用于多种类型的细胞微球，如肿瘤细胞微球、干细胞微球、肝细胞微球、神经细胞微球、乳腺微球和共培养微球等。本发明所述切片方法简便快捷，无需离心富集，无需琼脂糖、甘油蛋清等预包埋，从细胞微球的收集到蜡块制备完成仅需约2小时，制作的切片结构完整、细胞界限清楚，可操作性和实用性强。该方法制作的切片可行he染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色，是观察和分析细胞球的内部信息的有效方法。
5.本发明提供了一种3d细胞微球的石蜡切片方法，包括下述步骤：(1)样品固定；(2)预染；(3)脱水；(4)透明；(5)浸蜡包埋；(6)切片、捞片和展片；(7)烤片；(8)脱蜡；(9)复水；和(10)染色。
6.在一些实施方案中，本发明所述的样品固定为10％的中性福尔马林，室温固定20分钟以上。
7.在一些实施方案中，本发明所述的3d细胞微球的石蜡切片方法，其特征在于，所述的样品固定为：10％的中性福尔马林，室温固定20
‑
60分钟。在另一些实施方案中，本发明所
述的3d细胞微球的石蜡切片方法，其特征在于，所述的样品固定为：10％的中性福尔马林，室温固定20
‑
30分钟。在又一些实施方案中，本发明所述的3d细胞微球的石蜡切片方法，其特征在于，所述的样品固定为：10％的中性福尔马林，室温固定20、30、40、50或60分钟。
8.在一些实施方案中，所述的3d细胞微球为肿瘤细胞微球、干细胞微球、肝细胞微球、神经细胞微球、乳腺微球或共培养微球，优选地，所述细胞微球为肝细胞微球。
9.在一些实施方案中，所述的预染为：水溶性伊红染液或番红染液染色2分钟。
10.在一些实施方案中，所述的脱水为：用乙醇或其溶液进行梯度脱水，依次顺序为：
①
75％乙醇5分钟，
②
90％乙醇5分钟，
③
95％乙醇3分钟，
④
无水乙醇5分钟/次、连续3次。
11.在一些实施方案中，所述的透明为：用二甲苯、甲苯、苯或三氯甲烷进行透明，优选地，用二甲苯进行透明。
12.在一些实施方案中，所述的浸蜡包埋浸蜡时间为5
‑
10分钟。
13.在一些实施方案中，所述的切片、捞片和展片步骤中切片的厚度为2
‑
6μm，优选为3μm。
14.在一些实施方案中，所述的烤片为：42℃烘烤30分钟。
15.在一些实施方案中，所述的脱蜡为：二甲苯浸泡切片5分钟/次，重复3次。
16.在一些实施方案中，所述的复水为：用乙醇或其溶液浸泡切片复水，依次顺序为：
①
100％乙醇3分钟/次、连续2次，
②
95％乙醇2分钟，
③
70％乙醇2分钟。
17.具体地，本发明所采用的技术方案为：一种3d细胞微球石蜡切片方法，包括下述步骤：
18.1.样品固定：10％的中性福尔马林，室温固定20
‑
60分钟；
19.2.预染：水溶性伊红染液或番红染液染色2分钟；
20.3.脱水：用乙醇或其溶液进行梯度脱水，依次顺序为：
①
75％乙醇5分钟，
②
90％乙醇5分钟，
③
95％乙醇3分钟，
④
无水乙醇5分钟/次、连续3次；
21.4.透明：用二甲苯、甲苯、苯或三氯甲烷进行透明，每次5分钟，连续3次；
22.5.浸蜡包埋：浸蜡5
‑
10分钟；
23.6.切片、捞片和展片：切片厚度为3μm；
24.7.烤片：42℃烘烤30分钟；
25.8.脱蜡：二甲苯浸泡切片5分钟/次，重复3次；
26.9.复水：用乙醇或其溶液浸泡切片复水，依次顺序为：
①
100％乙醇浸泡3分钟/次、连续2次，
②
95％乙醇浸泡2分钟，
③
70％乙醇浸泡2分钟；
27.10.染色。
28.上述方法中，所述染色为he染色、免疫组织化学染色或免疫荧光染色。
29.在一些实施方案中，所述的he染色步骤为：(1)去离子水冲洗；(2)苏木素染色；(3)自来水冲洗；(4)1％盐酸
‑
75％乙醇分化；(5)蓝化处理；(6)终止分化；(7)伊红染色；(8)乙醇脱水；(9)二甲苯透明；和(10)封片。在另一些实施例方案中，所述蓝化处理为：用碳酸锂稀溶液进行蓝化处理。
30.在一些实施方案中，所述的免疫组织化学染色步骤为：(1)抗原修复；(2)通透；(3)封闭；(4)灭活过氧化物酶；(5)一抗孵育；(6)二抗孵育；(7)显色；(8)复染；(9)乙醇脱水；(10)二甲苯透明；和(11)封片。
31.在一些实施方案中，所述的免疫荧光染色步骤为：(1)抗原修复；(2)通透；(3)封闭；(4)一抗孵育；(5)二抗孵育；和(6)核染及封片。
32.本发明中，所述的伊红染液配方为：水溶性伊红y 0.5g、蒸馏水100ml、冰醋酸1滴，混合后即得到伊红染液。
33.本发明所述的石蜡是指熔点为56
‑
62℃的鳞片状切片石蜡。
34.本发明所述的苏木素染液配方为：硫酸铝钾15g、无水乙醇10ml、苏木精1g、蒸馏水200ml、氧化汞0.5g、冰醋酸10ml，混合溶清后即得到苏木素染液。
35.本发明所述的碳酸锂稀溶液为0.06％的碳酸锂溶液。
36.本发明的切片方法操作简单快捷，从细胞球的收集到蜡块制备完成仅需约2小时，非常高效，且解决了3d细胞微球体积小制片过程中易丢失的问题；并且，所述方法对实验室设备条件要求低，采用普通显微镜即可完成切片的观察操作，不需要使用昂贵的共聚焦显微镜，可以在缩短实验时长的同时节约成本。
附图说明
37.图1为按照本发明实施例1方法得到的人肝星形细胞(lx
‑
2)细胞微球包埋后细胞微球图。
38.图2为按照本发明实施例1方法得到的人肝星形细胞(lx
‑
2)细胞微球石蜡切片he染色图。
39.图3为按照本发明实施例2方法得到的免疫组织化学染色显示的白蛋白在hepg2和lx
‑
2细胞共培养细胞微球中的表达图。
40.图4为按照本发明实施例3方法得到的免疫荧光染色显示的白蛋白和波形蛋白在hepg2和lx
‑
2细胞共培养细胞微球中的表达图。
41.图5为按照本发明实施例4方法得到的人肝星形细胞(lx
‑
2)细胞微球石蜡切片he染色图。
具体实施方式
42.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
43.下面简写词的使用贯穿本发明：
44.pbs
ꢀꢀ
磷酸缓冲盐溶液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
m
ꢀꢀ
摩尔每升
45.tris
ꢀꢀ
三羟甲基氨基甲烷
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
mm
ꢀꢀ
毫摩尔每升
46.bsa
ꢀꢀ
牛血清白蛋白
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
μl
ꢀꢀ
微升
47.tbs
ꢀꢀ
三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水
ꢀꢀ
triton x
‑
100
ꢀꢀ
辛基苯基聚氧乙烯醚
48.dab
ꢀꢀ
二氨基联苯胺
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
dapi
ꢀꢀ
4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚
49.edta
ꢀꢀ
乙二胺四乙酸
50.实施例1 he染色的人肝星形细胞(lx
‑
2)细胞微球石蜡切片
51.本实施例根据本发明的方法制备得到lx
‑
2细胞微球的石蜡切片，并对切片进行了he染色，具体步骤如下：
52.1.样品固定：收集培养的3d肝细胞微球至离心管中，待细胞球沉淀或低速离心至
离心管底部后，移除上清培养基，加入适量的10％的中性福尔马林，室温固定30分钟；
53.2.预染：加入水溶性伊红染液染色2分钟；
54.3.脱水：移除伊红染液加入梯度乙醇或其溶液进行梯度脱水，依次按照
①
75％乙醇5分钟，
②
90％乙醇5分钟，
③
95％乙醇3分钟，
④
无水乙醇连续3次、每次5分钟的顺序进行；
55.4.透明：加入适量的二甲苯，进行透明，连续3次，每次5分钟；
56.5.浸蜡包埋：将细胞球转移至装有液体石蜡的包埋底模中，置于65℃恒温加热台或烘箱10分钟后取出，并将其置于冷板上使含细胞团的液体石蜡快速凝固，将凝固后的石蜡块取下，进行修蜡处理；包埋后的细胞微球如图1所示；
57.6.切片、捞片和展片：将修边后的蜡块置于切片机上进行切片，切片厚度为3μm，将切下的一层蜡带置于冷水中，用玻片在冷水中捞起蜡带，将其置于温水中使其展平，再贴于载玻片上于显微镜下观察细胞球切割情况；
58.7.烤片：将切好的片子置于42℃烘箱中烘烤30分钟；
59.8.脱蜡：二甲苯室温浸泡切片5分钟，重复3次；
60.9.复水：100％乙醇浸泡切片3分钟，连续2次；95％乙醇浸泡切片2分钟；70％乙醇浸泡切片2分钟；
61.10.he染色：
62.1)去离子水冲洗：去离子水冲洗2分钟；
63.2)苏木素染色：将切片置于苏木素染液中浸染5分钟；
64.3)自来水冲洗：将苏木素染色后的切片用自来水冲洗1分钟；
65.4)盐酸(1％)
‑
乙醇(75％)分化：盐酸
‑
乙醇溶液分化3秒；
66.5)蓝化处理：用碳酸锂稀溶液进行蓝化处理30秒；
67.6)终止分化：自来水浸泡10分钟终止分化；
68.7)伊红染色：将自来水分化处理后的切片用伊红染液浸染10分钟；
69.8)乙醇脱水：加入梯度乙醇进行梯度脱水，依次顺序为：95％乙醇连续2次，每次1分钟；无水乙醇连续3次，每次1分钟；
70.9)二甲苯透明：脱水结束后，进行二甲苯透明处理，连续2次，每次2分钟；
71.10)封片：用中性树胶将染色完成的切片进行封片处理，并用恒温箱将封好的切片作干燥处理。
72.在显微镜的40倍、100倍、200倍下，观察细胞球切片。
73.实验结果：按照本实施例方法制备的人肝星形细胞(lx
‑
2)细胞微球石蜡切片的he染色图如图2所示。
74.实验结论：上述方法制得的切片非常完整，染色后显微镜下细胞微球结构非常清晰。
75.实施例2 免疫组织化学染色的hepg2和lx
‑
2细胞共培养细胞微球石蜡切片
76.本实施例主要应用本发明的方法制备得到hepg2和lx
‑
2细胞共培养细胞微球的石蜡切片，其中，从样品固定到复水步骤同实施例1，对切片采用免疫组织化学染色，所述具体染色步骤如下：
77.1.抗原修复：将装有切片的架子放入pbs(0.01m，ph 7.2
‑
7.4)内清洗，微波炉加热
tris/edta抗原修复液(10mm tris,1mm edta,0.05％吐温
‑
20,ph 9.0)到100℃，将装有切片的玻片架放入煮沸的tris/edta修复液中，中火加热20分钟，取出容器放置冰水中快速冷却10分钟左右。
78.2.通透：含0.025％triton x
‑
100的1x tbs(ph 7.6)孵育样品10分钟，pbs洗涤3次，每次5分钟。
79.3.封闭：用封闭液(含10％山羊血清、1％bsa的1x tbs)在37℃下封闭1小时。
80.4.灭活过氧化物酶：
81.1)37℃复温45分钟；
82.2)用含0.025％triton x
‑
100的tbs漂洗3次，每次5分钟，并轻轻震荡；
83.3)将玻片在含0.3％h2o
2 tbs中孵育15分钟。
84.5.一抗孵育：使用含1％bsa的1x tbs稀释一抗，滴加100
‑
200μl一抗至每张切片，于湿盒内4℃过夜孵育。
85.6.二抗孵育：抗体使用1x tbs稀释，室温下避光孵育1小时。
86.7.显色：
87.1)在1x tbs中漂洗，连续3次，每次5分钟；
88.2)滴加dab试剂反应1分钟；
89.3)使用1x tbs洗涤切片终止显色。
90.8.复染：
91.1)使用苏木素试剂复染90秒，对细胞核进行染色；
92.2).将切片流水冲洗2分钟；
93.3)将切片浸入1％盐酸
‑
75％酒精分化10秒；
94.4)将切片流水冲洗2分钟，终止分化。
95.9.乙醇脱水：加入梯度乙醇进行梯度脱水，依次顺序为：95％乙醇连续2次，每次1分钟；无水乙醇连续3次，每次1分钟。
96.10.二甲苯透明：二甲苯透明处理连续2次，每次2分钟。
97.11.封片：中性树胶封片，并用恒温箱将封好的切片作干燥处理。
98.在显微镜的40倍、100倍、200倍下，观察细胞球切片。
99.实验结果：免疫组织化学染色的hepg2和lx
‑
2细胞共培养细胞微球石蜡切片中白蛋白的表达如图3所示。
100.实验结论：上述方法制得的切片非常完整，染色后显微镜下细胞微球结构非常清晰，可清晰观察到白蛋白的表达。
101.实施例3 免疫荧光染色的hepg2和lx
‑
2细胞共培养细胞微球石蜡切片
102.本实施例根据本发明方法制备得到hepg2和lx
‑
2细胞共培养细胞微球的石蜡切片，其中，从样品固定到复水步骤同实施例1，对切片采用免疫荧光染色，所述染色的具体步骤如下：
103.1.抗原修复：将装有切片的架子放入pbs(0.01m，ph 7.2
‑
7.4)内清洗，微波炉加热tris/edta抗原修复液(10mm tris，1mm edta，0.05％吐温
‑
20，ph 9.0)到100℃，将装有切片的玻片架放入煮沸的tris/edta修复液中，中火加热20分钟，取出容器放置冰水中快速冷却10分钟左右。
104.2.通透：含0.025％triton x
‑
100的1x tbs(ph 7.6)孵育样品10分钟，pbs洗涤3次，每次5分钟。
105.3.封闭：封闭液(含10％山羊血清、1％bsa的1x tbs)在37℃下封闭1h。
106.4.一抗孵育：使用含1％bsa的1x tbs稀释一抗，滴加100
‑
200μl一抗至每张切片，于湿盒内4℃过夜孵育。
107.5.二抗孵育：移除一抗，pbs洗3次，每次5分钟；滴加100
‑
200μl 1x tbs稀释好的二抗至每张切片，于湿盒中室温下避光孵育1小时。
108.6.核染及封片：滴加10
‑
20μl vector h1200(含dapi)，孵育10分钟，pbs洗去多余的dapi，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。
109.在荧光显微镜下观察采集图像。
110.实验结果：免疫荧光染色的hepg2和lx
‑
2细胞共培养细胞微球石蜡切片中白蛋白和波形蛋白的表达如图4所示。
111.实验结论：上述方法制得的切片非常完整，染色后显微镜下细胞微球结构非常清晰，可清晰观察到白蛋白和波形蛋白的表达。
112.实施例4 he染色的人肝星形细胞(lx
‑
2)细胞微球石蜡切片
113.本实施例根据本发明的方法制备得到lx
‑
2细胞微球的石蜡切片，并对切片进行了he染色，具体步骤参考实施例1，区别在于步骤1样品固定时间为20分钟，步骤5浸蜡时间为5分钟。
114.实验结果：按照本实施例方法制备的人肝星形细胞(lx
‑
2)细胞微球石蜡切片的he染色图如图5所示。
115.实验结论：上述方法制得的切片非常完整，染色后显微镜下细胞微球结构非常清晰。
116.以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
117.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
118.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。