新型冠状病毒抗原的检测试剂盒及应用、新型冠状病毒抗原的检测方法与流程

1.本技术涉及医学生物领域，特别涉及新型冠状病毒抗原的检测试剂盒及应 用、新型冠状病毒抗原的检测方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2)引发新型冠状病毒肺炎covid-19，是目前 已知的第7种可以感染人的冠状病毒。新型冠状病毒的检测对防控新型冠状病 毒肺炎有着至关重要的影响。
3.目前新型冠状病毒的检测方法主要是血清抗体检测和病毒核酸检测。病毒 特异性抗体一般在病毒入侵人体后约5天-15天产生，无法在早期进行血清抗体 检测，且血清抗体检测存在严重的假阴性和假阳性结果；与此同时，新型冠状 病毒核酸检测剂盒的质量参差不齐，核酸检测稳定的可靠性比较差，核酸检出 率低，许多病例要重复2-3次检测，但依然出现不少假阳性结果和假阴性结果。 因此，如何提高新型冠状病毒的早期检测率以及准确率，对于新型冠状病毒肺 炎的防控具有重要意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本技术提供了一种新型冠状病毒抗原的检测试剂盒，其检测限 低，能够在感染早期进行新型冠状病毒的检测，并且检测准确度高，可以实现 快速检测，有利于新型冠状病毒肺炎的防控。
5.第一方面，本技术提供了一种新型冠状病毒抗原的检测试剂盒，包括捕获 抗体、生物素标记的检测抗体、sars-cov2 n蛋白标准品、酶标亲和素、显色 液和终止液，所述捕获抗体包括抗sars-cov2 n蛋白捕获抗体，所述抗sars-cov2 n蛋白捕获抗体的重链可变区的序列包括如seq id no：1所示的氨 基酸序列，轻链可变区的序列包括如seq id no：2所示的氨基酸序列。
6.本技术提供的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒能够对新型冠状病毒进行定 性、定量检测；基于抗原抗体相互作用，捕获抗体与待测样本之间进行结合， 以及待测样本与检测抗体之间进行结合，而酶标亲和素和生物素能够特异性结 合，从而形成“捕获抗体-待测样本-生物素标记的检测抗体-酶标亲和素”复合 物，通过进行显色反应，从而可以对待测样本进行定性检测；进一步的，通过 采用特定序列的抗sars-cov2 n蛋白捕获抗体作为捕获抗体，其能够特异性且 高效地与抗原结合，降低新型冠状病毒的检测限，提升线性检测范围，更有利 于该检测试剂盒的使用。
7.可选的，所述检测抗体为北京义翘神州科技股份有限公司的货号为 40143-r040的兔抗sars-cov2 n蛋白抗体。
8.可选的，所述sars-cov2 n蛋白标准品为泰州市百英生物科技有限公司的 货号为b232004的n蛋白标准品。
9.可选的，所述新型冠状病毒抗原的检测试剂盒的最低检测限为46.8pg/ml。 本技术提供的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒的检测限低，在新型冠状病毒达 到46.8pg/ml时即可检测到，从而有利于新型冠状病毒肺炎的防控。
10.可选的，所述新型冠状病毒抗原的检测试剂盒的线性范围为 93.74pg/ml-1200pg/ml。本技术提供的新型冠状病毒抗原的检测线性范围广，准 确度高，可以应用于不同场景的新型冠状病毒的检测中。
11.可选的，所述检测试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液为含有吐温的磷酸盐 缓冲液。
12.可选的，所述检测试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为含有牛血清白蛋白 和/或脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液。采用上述封闭液能够有效地将检测孔中未包被 有捕获抗体的结合位点封闭起来，提高检测的准确度。
13.可选的，所述酶标亲和素包括过氧化物酶标记的亲和素。进一步的，所述 酶标亲和素包括辣根过氧化物酶标记的亲和素。更进一步的，所述酶标亲和素 包括辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
14.可选的，所述显色液包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)溶液。在过氧化物 酶的作用下，tmb溶液的颜色发生变化，从而可以根据tmb溶液是否发生变色， 以及变色前后溶液的吸光度，从而对待测样本中的新型冠状病毒进行定性、定 量检测。
15.可选的，所述终止液包括硫酸溶液。通过加入硫酸溶液可以破坏酶标亲和 素中酶分子的活性，从而停止酶分子与显色液之间的显色反应，保证检测结果 的准确性。
16.本技术提供的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒的检测限低，能够在感染早 期对新型冠状病毒进行检测，从而可以有效防控新型冠状病毒肺炎，同时该检 测试剂盒能够对新型冠状病毒准确检测，避免假阳性和假阴性现象，并且检测 迅速，有利于其应用。
17.第二方面，本技术提供了第一方面所述的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒 在不以疾病诊断和/或治疗为目的的新型冠状病毒抗原的检测中的应用。
18.本技术提供的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒可以用于不以疾病诊断和/或 治疗为目的的新型冠状病毒抗原的检测中，如对环境中新型冠状病毒抗原进行 检测，从而判断环境是否安全，有利于新型冠状病毒肺炎的防控。
19.第三方面，本技术提供了一种不以疾病诊断和/或治疗为目的的新型冠状病 毒抗原的检测方法，包括采用第一方面所述的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒 检测新型冠状病毒抗原。
20.可选的，所述检测方法包括：
21.将所述捕获抗体分散至磷酸盐缓冲液，得到捕获抗体溶液，将所述生物素 标记的检测抗体分散至磷酸盐缓冲液，得到检测抗体溶液；
22.将所述捕获抗体溶液加入至检测孔中，以使所述捕获抗体包被在所述检测 孔内；
23.将预处理后的待测样本加入至所述检测孔中孵育，然后进行清洗；
24.将所述检测抗体溶液加入至所述检测孔中孵育，然后进行清洗；
25.向所述检测孔中加入所述酶标亲和素后，再加入显色液进行显色反应，之 后加入所述终止液终止所述显色反应；
26.根据所述检测孔的颜色变化进行定性检测，和/或测量所述检测孔的od
450
值并与
标准曲线进行比较，获得所述待测样本中新型冠状病毒抗原的浓度。
27.进一步的，所述标准曲线的制作包括：
28.将所述捕获抗体包被在多个所述检测孔内；
29.将所述sars-cov2 n蛋白标准品稀释，形成多个不同浓度的sars-cov2 n 蛋白溶液，将所述多个不同浓度的sars-cov2 n蛋白溶液分别加入至不同的所 述检测孔中，然后进行清洗；
30.将所述检测抗体溶液加入至每一所述检测孔中孵育，然后进行清洗；
31.向所述检测孔中加入所述酶标亲和素后，再加入显色液进行显色反应，之 后加入所述终止液终止所述显色反应；
32.测量多个所述检测孔的od
450
值，并根据所述sars-cov2 n蛋白溶液浓度 与所述od
450
值获得所述标准曲线。
33.更进一步的，所述sars-cov2 n蛋白溶液与所述检测抗体的浓度比为4.68
ꢀ×
10-5-1.2
×
10-2
。采用上述浓度比，可以使得sars-cov2 n蛋白与检测抗体高效、 快速、特异性地结合，降低最低检测限，有利于在早期新型冠状病毒浓度较低 时，可以对其进行有效检测。
34.进一步的，所述显色液的浓度为0.01％-0.2％，所述终止液的浓度为1m-4m。
35.本技术提供的新型冠状病毒抗原的检测方法操作简单、检测时间短、采样 便捷，降低了假阳性和假阴性的概率，提高了检测准确度。
附图说明
36.图1为本技术一实施方式提供的新型冠状病毒抗原的检测方法的流程图。
37.图2为本技术一实施方式提供的新型冠状病毒抗原的检测方法中标准曲线 的制作流程图。
38.图3为本技术一实施方式提供的新型冠状病毒抗原的检测方法中标准曲线 图。
具体实施方式
39.以下所述是本技术的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这 些改进和润饰也视为本技术的保护范围。
40.本技术提供了一种新型冠状病毒抗原的检测试剂盒，包括捕获抗体、生物 素标记的检测抗体、sars-cov2 n蛋白标准品、酶标亲和素、显色液和终止液， 捕获抗体包括抗sars-cov2 n蛋白捕获抗体，抗sars-cov2 n蛋白捕获抗体 的重链可变区的序列包括如seq id no：1所示的氨基酸序列，轻链可变区的序 列包括如seq id no：2所示的氨基酸序列。
41.相关技术中，采用血清抗体进行新型冠状病毒检测时，由于血清中抗体的 产生需要时间，从而无法在早期进行有效检测，并且假阳性和假阴性现象严重； 通过病毒核酸检测新型冠状病毒时，需要进行核酸提取等复杂过程，从而在提 取过程中容易污染，降低检测速度和准确度。而本技术提供的检测试剂盒是针 对新型冠状病毒的核衣壳蛋白(n蛋白)，其能够在患者感染新型冠状病毒的早 期产生，从而有利于新型冠状病毒的早期检测，对于新冠患者的及时确诊、治 疗以及新冠的防控有着重要意义。进一步的，本技术提供的检测试剂盒中采用 的特定序列的抗sars-cov2 n蛋白捕获抗体，其能够高效、特异性地结
0.2％。具体的，洗涤液的浓度可以但不限于为0.01％、 0.05％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.18％或0.2％等。在一具体实施例中， 可以将500μl吐温-20加入至1l磷酸盐缓冲液中，获得洗涤液。
51.在本技术实施方式中，检测试剂盒中还包括封闭液，封闭液为含有牛血清 白蛋白和/或脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液。采用上述封闭液能够有效地将检测孔中 未包被有捕获抗体的结合位点封闭起来，提高检测的准确度。在本技术一实施 例中，封闭液为含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，其容易长期保存和使用。 进一步的，封闭液的浓度为0.5％-5％。具体的，洗涤液的浓度可以但不限于为0.5％、 0.7％、1％、1.3％、1.5％、2％、2.8％、3％、4％或4.5％等。在一具体实施例中， 可以将1g牛血清白蛋白加入至100ml磷酸盐缓冲液中，获得封闭液。
52.在本技术实施方式中，酶标亲和素包括过氧化物酶标记的亲和素。进一步 的，酶标亲和素包括辣根过氧化物酶标记的亲和素。更进一步的，酶标亲和素 包括辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-hrp)。在本技术一实施例 中，酶标亲和素为液态，其中溶质可以但不限于为磷酸盐缓冲液。进一步的， 液态酶标亲和素的浓度为0.05％-2％。具体的，液态酶标亲和素的浓度可以但不 限于为0.05％、0.07％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、1.2％、1.5％、1.8％或2％等。 在一具体实施例中，可以将1ml酶标亲和素溶于200ml磷酸盐缓冲液中，获得液 态酶标亲和素。
53.在本技术实施方式中，显色液包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)溶液。在 过氧化物酶的作用下，tmb溶液的颜色发生变化，从而可以根据tmb溶液是否 发生变色，以及变色前后溶液的吸光度，从而对待测样本中的新型冠状病毒进 行定性、定量检测。
54.在本技术实施方式中，终止液包括硫酸溶液。通过加入硫酸溶液可以破坏 酶标亲和素中酶分子的活性，从而停止酶分子与显色液之间的反应，保证检测 结果的准确性。在本技术一实施例中，终止液的浓度为1m-4m。具体的，终止 液的浓度可以但不限于为1m、2m、3m或4m等。
55.在本技术实施方式中，检测试剂盒还包括酶标板，酶标板用于包被捕获抗 体。
56.本技术提供的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒的检测限低，能够在感染早 期对新型冠状病毒进行检测，从而可以有效防控新型冠状病毒肺炎，同时该检 测试剂盒能够对新型冠状病毒准确检测，避免假阳性和假阴性现象，并且检测 迅速，有利于其应用。
57.本技术还提供了上述任一实施方式中的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒在 不以疾病诊断和/或治疗为目的的新型冠状病毒的检测中的应用。本技术提供的 新型冠状病毒抗原的检测试剂盒可以用于不以疾病诊断和/或治疗为目的的新型 冠状病毒的检测中，如对环境中新型冠状病毒进行检测，从而判断环境是否安 全，有利于新型冠状病毒肺炎的防控。
58.本技术还提供了一种不以疾病诊断和/或治疗为目的的新型冠状病毒抗原的 检测方法，包括采用上述任一实施方式中的新型冠状病毒抗原的检测试剂盒检 测新型冠状病毒。
59.请参阅图1，为本技术一实施方式提供的新型冠状病毒抗原的检测方法的流 程图，包括：
60.s101：将捕获抗体分散至磷酸盐缓冲液，得到捕获抗体溶液，将生物素标 记的检
测抗体分散至磷酸盐缓冲液，得到检测抗体溶液。
61.s102：将捕获抗体溶液加入至检测孔中，以使捕获抗体包被在检测孔内。
62.s103：将预处理后的待测样本加入至检测孔中孵育，然后进行清洗。
63.s104：将检测抗体溶液加入至检测孔中孵育，然后进行清洗。
64.s105：向检测孔中加入酶标亲和素后，再加入显色液进行显色反应，之后 加入终止液终止显色反应。
65.s106：根据检测孔的颜色变化进行定性检测，和/或测量检测孔的od
450
值并 与标准曲线进行比较，获得待测样本中新型冠状病毒抗原的浓度。
66.在本技术中，通过将捕获抗体包被在检测孔中，在孵育过程中与待测样本 中的新型冠状病毒结合、待测样本中的新型冠状病毒再与生物素标记的检测抗 体结合、生物素标记的检测抗体再与酶标亲和素结合，从而形成复合物；再加 入显色液进行显色，以及显色后加入终止液终止反应，根据颜色变化进行定性 检测，还可以根据标准曲线进行定量检测。
67.在本技术实施方式中，检测孔可以但不限于为酶标板。
68.在本技术实施方式中，在待测样本加入到检测孔前，还包括用封闭液处理 检测孔，从而使得检测孔中未被捕获抗体结合的位点封闭起来。
69.在本技术实施方式中，采用洗涤液进行清洗处理。
70.在本技术中，检测孔的颜色变化进行定性检测包括：当加入显色液后，反 应体系从无色变为蓝色，并在加入终止液后变为黄色，则判断该待测样本中具 有新型冠状病毒；当加入显色液后，反应体系颜色不变，并在加入终止液后颜 色不变，则判断该待测样本中不具有新型冠状病毒。
71.请参阅图2，为本技术一实施方式提供的新型冠状病毒抗原的检测方法中标 准曲线的制作流程图，包括：
72.s201：将捕获抗体包被在多个检测孔内。
73.s202：将sars-cov2 n蛋白标准品稀释，形成多个不同浓度的sars-cov2 n蛋白溶液，将多个不同浓度的sars-cov2 n蛋白溶液分别加入至不同的检测 孔中，然后进行清洗。
74.s203：将检测抗体溶液加入至每一检测孔中孵育，然后进行清洗。
75.s204：向检测孔中加入酶标亲和素后，再加入显色液进行显色反应，之后 加入终止液终止显色反应。
76.s205：测量多个检测孔的od
450
值，并根据sars-cov2 n蛋白溶液浓度与 od
450
值获得标准曲线。
77.本技术提供的方法获得的标准曲线的线性范围广，检测限低，从而有利于 检测。
78.在本技术一实施例中，sars-cov2 n蛋白溶液与检测抗体的浓度比为4.68
ꢀ×
10-5-1.2
×
10-2
。采用上述浓度比，可以使得sars-cov2 n蛋白与检测抗体高效、 快速、特异性地结合，降低最低检测限，有利于在早期新型冠状病毒浓度较低 时，可以对其进行有效检测。
79.在本技术一实施例中，标准曲线的制作包括：将捕获抗体以100μl/孔加到酶 标板，4℃过夜，用洗涤液(如0.05％pbst溶液)洗板3次；加入封闭液(如 1％bsa-pbs溶液)，200μl/孔，37℃孵育1h，用洗涤液洗板3次；把sars-cov2 n 蛋白标准品稀释为46.87pg/ml、93.75pg/ml、187.5pg/ml、375pg/ml、750pg/ml、 1500pg/ml、3000pg/ml、6000pg/ml、
12000pg/ml，以100μl/孔分别加入到酶标 板中，每个浓度三个检测孔，37℃放置2h，用洗涤液洗板3次；加入生物素标记 的检测抗体，100μl/孔，37℃放置1h，用洗涤液洗板3次；加入酶标亲和素(如 streptavidin-hrp溶液)，100μl/孔，37℃放置30min；加入显色液(如tmb溶液)， 100μl/孔，避光放置20min；加入终止液(如硫酸溶液)，100μl/孔；测定各个检 测孔的od
450
值；根据sars-cov2 n蛋白溶液浓度与od
450
值获得标准曲线，该 标准曲线如图3所示，其中标准曲线横坐标为sars-cov2 n蛋白溶液浓度 (pg/ml)，纵坐标为od
450
值，标准曲线为y＝0.0002x+0.0139，r2＝0.9986；其最 低检测限为46.87pg/ml，线性范围为93.75pg/ml-12000pg/ml。
80.在本技术一实施例中，洗涤液的浓度为0.01％-0.2％，封闭液的浓度为 0.5％-5％，显色液的浓度为0.01％-0.2％，终止液的浓度为1m-4m。具体的，可以 根据检测需要进行选择。
81.本技术提供的新型冠状病毒抗原的检测方法操作简单、检测时间短、采样 便捷，降低了假阳性和假阴性的概率，提高了检测准确度。
82.以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本技术专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附 权利要求为准。