本发明属于生物，涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的新方法（夹心阻断elisa）。
背景技术：
1、口蹄疫（foot and mouth disease, fmd）是由口蹄疫病毒(foot and mouthdisease virus, fmdv)引起的猪、牛、羊等偶蹄动物易感的一种急性、热性、高度接触性传染病,被感染动物多以在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹为主要临床特征，该病传播途径多、速度快，每次爆发均会给当地的畜牧养殖业造成巨大经济损失。世界动物卫生组织（woah）将其列为必须申报的传染病，我国也将其列在一类动物传染病的首位。口蹄疫病毒在全世界主要有七个血清型:o、a、亚洲1、c型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段我国主要针对o型和a型口蹄疫病毒进行疫苗接种。
2、口蹄疫血清型特异性抗体检测是疫苗免疫效果评估及流行病学调查采用的主要血清学调查手段之一。液相阻断elisa方法检测口蹄疫抗体是世界动物卫生组织指定的参考方法，传统液相阻断elisa方法需要将被检血清与抗原预先在载体反应板上充分孵育作用后再移板至已包被捕获抗体的elisa板内；抑制elisa方法是兰州兽医研究所科研人员基于病毒中和试验基本原理建立的新方法,该方法将血清抗原直接在捕获抗体的elisa板内反应,省去了抗原抗体预先孵育的步骤,缩短了操作时间；双抗体夹心elisa方法是woah推荐的fmdv定型方法，血清型特异性单抗是该方法的关键试剂；基于单克隆抗体发展起来的抗体竞争elisa方法,操作简便、省时,具有较高的特异性。口蹄疫疫苗免疫动物抗体检测是我国每年口蹄疫防疫程序中要求必检的内容。
3、目前，液相阻断elisa方法是农业部指定口蹄疫免疫抗体检测方法，抑制elisa方法作为传统液相阻断elisa方法的升级版，已被全国各级兽医诊断实验室广泛采用，与口蹄疫病毒抗体单抗竞争elisa方法相比，抑制elisa方法仍然有进一步简化操作步骤、缩短操作时间的用户需求；基于单抗的口蹄疫病毒双抗体夹心elisa定型方法具有敏感性好、型特异性高的优点，单抗竞争elisa方法检测口蹄疫抗体的敏感性不如液相阻断elisa方法，但由于其操作步骤简便、用时短，越来越多的被用于口蹄疫抗体的检测。
4、口蹄疫病毒包括完整病毒粒子（146s）、空衣壳(76s)、病毒感染相关肽(45s)、小分子蛋白（12s），146s抗原是口蹄疫疫苗中使动物肌体产生保护性抗体的主要免疫成分。纯化146s抗原免疫实验动物制备的多克隆抗体及鼠源骨髓瘤融合小鼠脾细胞筛选杂交瘤技术制备单克隆抗体常被用作试剂材料，是液相阻断elisa、抑制elisa、夹心elisa、单抗竞争elisa采用的技术方案。单克隆抗体是通过杂交瘤筛选出针对口蹄疫病毒主要免疫原vp1基因蛋白特异性反应的细胞株分泌的抗体。
5、如何对现有方法进行优化创新，是建立口蹄疫抗体检测新方法需要解决的一个关键问题。新方法应该具有液相阻断elisa、抑制elisa检测同样的敏感性、特异性和稳定性，具有单克隆抗体竞争elisa一样的操作简便性，并且能最大限度的减少操作造成的试验失败。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种能够检测口蹄疫抗体的新方法—夹心阻断elisa方法，其基本原理是在已包被口蹄疫型特异抗体的elisa板上将被检血清和阴阳性对照血清按一定的比例进行系列稀释后紧接着加入酶标抗体，最后加入稀释至工作浓度的口蹄疫灭活病毒抗原，设置至少4孔病毒抗原对照（对照孔内预先加等量的血清稀释液），最终反应体系为200ul/孔，经孵育洗涤后加入tmb底物，显色终止后od450nm波长读取吸光值。被检血清或阴阳性对照血清中的抗体阻断病毒抗原参与夹心反应的进行，以病毒抗原对照4孔的平均值的50%作为病毒抗原被50%阻断的临界值，结果判定与液相阻断elisa方法基本一致。本发明将这种elisa检测技术命名为夹心阻断elisa方法，也可称为液相阻断elisa一步法。
2、与液相阻断elisa、抑制elisa测定血清抗体的相同点：两种方法所用的关键试剂（兔抗口蹄疫病毒血清、病毒抗原）相同。
3、与液相阻断elisa、抑制elisa测定血清抗体的区别：液相阻断elisa方法测定抗体需要将抗原、抗体预先在反应板上充分作用后再转移至elisa板上，操作时间需要2天；抑制elisa方法需要将被检血清直接在elisa板上稀释后加入病毒抗原，反应时间上抑制elisa方法完整操作过程可以在2小时内完成；夹心阻断elisa方法，被检血清、阴阳性对照血清、酶标抗体、病毒抗原均在一步反应内完成，用时30分钟。
4、本发明在国内外率先突破了液相阻断elisa、抑制elisa、单抗竞争elisa及双抗夹心elisa方法的利用，首次实现了液相阻断elisa方法复杂的操作步骤简化为一步完成，检测敏感性与液相阻断elisa一致，提高了检测特异性，是口蹄疫抗体检测更为理想、适用的elisa方法。
5、为了达到该目的，本发明所采取的技术方案步骤如下：
6、1． 通过利用破乳的方法对口蹄疫灭活疫苗破乳后得到口蹄疫病毒抗原，作为抗血清制备抗原和检测用到的病毒抗原；
7、2．口蹄疫病毒146s抗原纯化（蔗糖密度梯度离心法） ；
8、3．兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清、阴阳性参考血清制备；
9、4．balb/c小鼠免疫、杂交瘤细胞制备、单克隆抗体细胞株筛选、腹水制备；
10、5．阳性对照血清抗体效价测定（液相阻断elisa方法）；
11、6．单抗腹水制备、测定、igg抗体纯化及hrp标记；
12、7．操作步骤优化；
13、8．结果判定；
14、9．敏感性和特异性分析；
15、10．与液相阻断elisa方法符合性（敏感性、特异性）。
16、具体的，本发明为一种用于检测口蹄疫病毒抗体的夹心阻断elisa方法，其特征在于通过在已包被口蹄疫型特异抗体的elisa板上将被检血清及阴阳性对照血清按要求稀释后加入酶标抗体，每板设置4孔不加血清对照（对照孔预先加等量的血清稀释液），最后加入稀释至工作浓度的病毒抗原，最终反应体系为200ul/孔。被检血清及阴阳性血清中的口蹄疫型特异抗体阻断病毒抗原参与夹心反应的进行。以4孔不加血清对照od值平均值的50%表示病毒抗原被阻断50%的临界值，如果该临界值处于某份被检血清某相邻两个稀释度od值之间，则该份血清的抗体效价取该相邻两个稀释滴度的中间值，与液相阻断elisa方法的判定方法一致。
17、在本发明所述的方法中，优选的，所述的口蹄疫病毒抗原为血清型特异的口蹄疫病毒抗原，可以是口蹄疫病毒灭活得到的，也可以是经口蹄疫灭活疫苗破乳后得到的。优选的，所属的酶标抗体，可以是1株及以上单克隆抗体标记hrp后混合使用，也可以是146s抗原免疫制备多克隆抗体标记hrp后使用。
18、优选的，本发明所述的方法，具体的包括以下步骤：
19、（1）口蹄疫灭活疫苗破乳获得口蹄疫型特异病毒抗原；
20、（2）口蹄疫病毒146s抗原纯化；
21、（3）兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清及阴阳性参考血清制备；
22、（4）豚鼠抗口蹄疫病毒血清igg纯化、型特异性单克隆抗体制备及hpr标记；
23、（5）标准阳性血清抗体效价测定（液相阻断elisa）；
24、（6）兔抗血清、酶标抗体及病毒抗原浓度的确定；
25、（7）操作步骤的优化；
26、（8）结果判定。
27、a、包被elisa板
28、用ph值9.6 0.05m碳酸盐缓冲液将血清型特异的兔抗fmdv 血清稀释并包被elisa板，100µl/孔，室温过夜，pbst洗板5次，干燥处理后真空包装，4℃保存。
29、b、血清稀释
30、在已包被兔抗口蹄疫病毒血清的elisa板上按每孔50µl量加入血清稀释液，将阴阳性对照血清及被检血清按要求在elisa板内进行2倍连续稀释。每块反应板均设置至少4孔不加血清对照（预先加入50µl的血清稀释液），elisa反应板内体系均为50µl/孔。
31、c、加酶标抗体
32、在血清样品稀释后紧接着加入酶标抗体，50ul/孔，反应体系变为100ul/孔。
33、d、加病毒抗原
34、最后加入稀释至工作浓度的病毒抗原，每孔100µl，最终反应体系为200ul/孔。封板，震荡， 37℃孵育30分钟。
35、e、底物及终止反应
36、用1倍pbst洗板3~5次，加入tmb底物溶液，单组分为50µl/孔或双组分ab液各50ul/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入50µl的2mh2so4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
37、f、结果判定
38、以病毒抗原对照4孔od值平均值的50%作为病毒抗原被阻断50%的临界值，将阴阳性对照血清和被检血清相应孔的od值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔od值略高于临界值与略低于临界值孔（相邻两孔）对应的抗体滴度的平均值。抗体效价≥64判为口蹄疫抗体阳性。
39、在本发明所述的方法中，标准阳性血清的抗体效价由兰州兽医研究所生产的液相阻断elisa试剂盒测定。
40、在本发明以上任一项所述的方法，所述的fmdv抗原包括o型fmdv抗原及a型fmdv抗原。
41、本发明利用将阴阳性血清及被检血清直接在已包被捕获抗体的elisa板上稀释后紧接着加入等量的酶标抗体，最后加入又等体积的稀释至工作浓度的病毒抗原，同时设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入等体积的血清稀释液），被检血清及阴阳性血清中口蹄疫型特异抗体阻断病毒抗原参与酶标单抗与elisa板上的捕获抗体的双抗夹心elisa反应的进行，判定参照液相阻断elisa方法，以病毒抗原对照孔od值平均值的50%作为病毒抗原被50%阻断的临界值，成功地建立起了阻断夹心elisa方法，也成为液相阻断elisa一步法，可用于定性、定量检测口蹄疫抗体。
42、有益效果：本发明创造性的解决了传统液相阻断elisa方法繁琐步骤简化的难题，解决了被检血清、捕获抗体、酶标抗体同时与病毒抗原感作的难题，解决了从口蹄疫灭活疫苗破乳得到检测用病毒抗原的方法，解决了试验操作过程中各种试剂需要临时配制、操作繁琐、不稳定、费时的难题。因此，本发明成功的建立了与传统液相阻断elisa方法相比较，在检测口蹄疫抗体时操作更为简便、省时、稳定的夹心阻断elisa方法，即液相阻断elisa一步法，为口蹄疫免疫抗体监测、疫苗免疫效果评估、流行病学调查、免疫指导等提供了新的技术支持。