专利名称：用于测定蛋白质的干式分析单元的制作方法
本申请要求1997年5月6日提交的申请号为60/045754临时申请的优先权。
本发明涉及干式分析单元及使用它来定量液体样品中蛋白质的方法。更具体地说，本发明涉及特定的染料和钼酸根离子，包含丙烯酰胺的聚合物以及羟基羧酸在该分析单元中的用途。
在医学实践和研究以及分析和诊断方法中一直都需要快速准确地测定存在于各种液体，如生物体液中的化学和生物物质。例如，为了有效地研究、诊断和治疗许多人类疾病，必须快速准确地确定蛋白质的存在和含量。
在最近几十年已经建立了各种各样的分析方法来检测这些重要物质。这些方法可信度高，并且在一些情况下适宜于自动化以及适合以试剂盒的形式使用。
蛋白质分析传统上在溶液中，或者在其中液体被以某种方式从参与分析的试剂中除去的实验设备中进行。尽管在本领域中溶液方法已令人欣喜地被广泛接受，但是它们一般需要通常具有复杂的溶液处理和运输能力的分析设备。而且，用于该分析法的分析设备可能涉及复杂的液体处理，并且对于可能被需要避免样品与样品间污染的操作和严格清洗可能均需要熟练人员。
作为溶液化学的一种替代方法是使用干式分析单元。但应该认识到由于来自涂层剂，如粘合剂、表面活性剂以及为促进或者利于物质沉积，样品润湿以及保持所述单元结构完整所需的其他试剂的干扰，并非所有溶液基分析测定都可适用于干式分析单元。而且，干式分析单元必须采用原位区域化以分隔不相容的成分。而在其中可采用分离的液体贮存和连续的液体加入的溶液化学中并非如此。
干式分析单元以及它们的使用已在大量的出版物中被描述，包括Pierce等人的美国专利US4132528、US4786605、US3992158、US4258001，Frickey等人的美国专利US4670381，WO822601(1982年8月5日公开)，欧洲专利申请号051183(1982年5月12日公开)以及欧洲专利申请号066648(1982年12月15日公开)。其所引用的全部内容在此引入作为参考。
确定和监测患者肾功能的一个有用的诊断指标是尿中的总蛋白浓度。存在于尿中的蛋白的性质和含量是变化的，且取决于导致肾脏不能阻止蛋白质进入尿中的特定的病理状态。
在尿中可能发现的蛋白的实例包括，但并不仅限于，白蛋白、完整的免疫球蛋白、κ自由链、λ自由链、维生素A结合蛋白、α-1-微球蛋白和β-1-微球蛋白。这些蛋白质在氨基酸组成和分子量上大不相同。使用尿总蛋白筛选检测分析的临床医生所感兴趣的信息是每单位体积尿样中的蛋白质的总量。诊断分析，即所测信号在理想状态下应与可能存在的蛋白质的性质或种类无关。例如，50mg/dL白蛋白应产生与50mg/dL任何其他蛋白相同的信号。人尿中正常的蛋白浓度范围为大约5～100mg/dL。
各种各样的手段已被用于确定生物材料中的总蛋白浓度。在许多分析测定中，测定光学信号，如光谱的可见光区或紫外光区的吸收，其中该光学信号与样品中蛋白浓度成比例。然而，通常这些信号不为所希望地随样品中蛋白质的性质变化而并不单单与所存在的蛋白的含量有关。这些方法通常依赖于下列方式之一来产生能检测的光学信号1.蛋白质和Cu(II)的络合物，双缩脲反应在光谱的可见区产生可检测却很小的吸收。2.可测定蛋白质的芳香族氨基酸在光谱紫外区的吸收。3.可通过用含发色团的分子衍生特定的氨基酸测定蛋白质的含量，其中含发色团的分子可用其内在的吸收或荧光来定量。4.可使用能与蛋白非共价结合产生导致染料吸收光谱微扰的染料-蛋白质络合物的染料来确定样品中蛋白质的存在或含量。一些染料需要金属离子的存在，如钼或钨，在这种情况下，染料、金属离子和蛋白质形成的非共价络合物导致可用来确定样品中蛋白质的存在或含量的染料吸收光谱的微扰。5.蛋白质和染料对与Cu(II)的配位结合的竞争导致与蛋白质浓度成比例的吸收信号(Cu(II)/染料配位结合络合物具有与游离染料，即未与Cu(II)配位结合的染料不同的吸收光谱)。
美国专利US4132528涉及基于双缩脲反应的蛋白质测定。`528专利中的干式分析单元包括双缩脲试剂Cu(II)和其螯合剂，例如，CuSO4和酒石酸或二者的络合物以及提供pH大于约12的缓冲液。当pH值大于12，存在于含水液体，如血清或脑脊液(CSF)中的蛋白质与双缩脲试剂相互作用时，二价形式的铜与蛋白质发生反应产生紫色。颜色强度与血清中蛋白含量成正比，并且蛋白质水平能够通过熟知的比色分析方法来测定。不幸的是，所述专利中干式载片单元具有比希望更低的灵敏度，即它们不能检测约200mg/dL或以下的蛋白质水平。
美国专利US4786605描述了具有比`528专利中的单元更高的灵敏度的用于蛋白质定量的干式分析单元制品，其中它通过用预先制备的Cu(II)/吡啶偶氮染料配位结合络合物(或游离态Cu(II)与游离态的吡啶偶氮染料)代替双缩脲试剂。当蛋白水溶液加入到分析单元中时，二价铜离子被蛋白质从络合物中置换出来，并且Cu(II)/染料络合物的吸收曲线偏移未配位结合结合的染料的吸收曲线。因此，当蛋白质被加入时，Cu(II)/染料络合物的吸收峰与加入的蛋白量成比例地减少，并且从用含有已知浓度的蛋白的样品进行适当的校正出发，可用比色法测定液体样品中的未知的蛋白浓度。该专利教导说，那些单元具有极其良好的动态范围并且具有比基于双缩脲反应的单元高约30的灵敏度。
然而，将`605专利的方法用于定量尿样中的蛋白却总会显示这一现象，即与用考马斯蓝溶液分析蛋白质浓度作为参考标准而获得的值比较，约10～20％的尿样出现令人无法接受的随机阳性偏差，也就是说，用`605专利方法所测定的某些患者尿样(约10～20％的样品群)的蛋白浓度高于用基于考马斯蓝的分析法所测得值。推测该随机阳性偏差是由于某些尿样中还原剂，如抗坏血酸的存在而造成的，其中这些还原剂导致Cu(II)和位于染料上的如硝基的可还原基团减少。因此，期望一种不易受上述测定方法缺陷影响的干式分析单元。
业已熟知产生可检测的颜色变化的在酸性条件下的特定的指示剂染料与蛋白质和金属离子在溶液中的络合反应。如上所述，由于本文提到的原因，在溶液中能很好进行的分析测定方法可能不易适合于干式分析单元。
特别希望不同的蛋白质与染料同等地反应来产生光学信号，其中这种信号与样品中存在的蛋白量有关且与蛋白质的性质无关。尿含有可变量的碳酸氢钠(高达约200mM)。假如未经稀释或样品的预处理(例如采用分子大小排阻技术)除去，尿样中高水平的碳酸氢钠可使大量的碳酸氢钠进入测定中而产生可能使得测定不可信或毫无用处的强碱状态，因为在低pH值(1.5～3.5)条件下发生染料-金属离子-蛋白质的相互作用和/或另外碳酸氢钠可通过金属离子的配位作用起干扰作用。需要提供不易受还原剂或碳酸氢钠存在影响的测定蛋白质的干式分析单元，其中它产生与存在的蛋白量基本相关的信号大小，即基本上(其中基本指适合于或可接受地用于特定蛋白质的测定用途，如尿样中总蛋白的测定)与蛋白质的性质无关的信号大小，并可被用来定量约5～约300mg/dL范围内的蛋白质，且不需要样品的预稀释，预浓缩，或除去所述干扰成分的预处理。
出人意料地发现能够制备一种在存在钼酸根离子和包含丙烯酰胺的聚合物时包含指示剂染料和羟基羧酸化合物的适用于测定生物液体中蛋白含量或存在的干式分析单元。
通过在存在钼酸根离子与丙烯酰胺聚合物时，在本发明的干式分析单元中使用指示剂染料以及羟基羧酸化合物解决了现有技术中的用于测定蛋白质浓度的干式分析单元的问题。钼酸根离子是本发明具体实施方案的优选的金属离子。但是，本发明的具体实施方案并不仅限于钼酸根离子。其他合适的金属离子，如钨酸根离子也被认为在本发明的范围之内。
如上面提到的，特别希望不同的蛋白质同等地与染料发生反应以产生与样品中存在的蛋白的量相关且与蛋白质的性质无关的光学信号。出人意料地发现用于涂布干式单元中各种试剂的聚合物载体影响指示剂染料系统与不同蛋白质间的表观反应性。因此，所测量的光学信号的大小取决于存在的蛋白的性质或种类；但是，当含丙烯酰胺的聚合物存在于干式分析单元中时，这种对蛋白质种类的依赖性被显著降低。
本文公开了基于测定在存在钼酸铵，指示剂染料与蛋白形成络合物时的在适宜波长下的反射强度的变化的用于定量样品中总蛋白的干式分析单元。本发明的干式分析单元可用于测定任何液体样品，尤其是生物液体中的蛋白质的量。
更具体地说，在一个具体实施方案中，本发明涉及可用于蛋白质的检测及定量的干式分析单元，包括(i)一层多孔铺展层，(ii)与多孔铺展层液体接触的一层或多层其它的层，和(iii)载体其中所述单元在至少一层中包含含有丙烯酰胺的聚合物、在所述单元与被推测含有蛋白质的液体接触时发生反应引起染料光吸收或反射强度的可测定变化的指示剂染料和钼酸根离子，并且其中所述染料，所述钼酸盐和所述含丙有烯酰胺的聚合物可一起存在于同一层中，或者以任何混合的形式或单独存在于所述单元的各层中。
本发明提供了一种使用上述干式分析单元检测和定量蛋白质的方法，其中包括(A)将一种具有下式结构的羟基羧酸加入到被推测含有蛋白质的液体样品中
其中R1和R2独立地为H、-CH3、-CH2CH3或-CH2OH，M为H或带正电金属离子或非金属抗衡离子；(B)将含有羟基羧酸的液体样品与所述分析单元接触；并且(C)测定染料的光吸收或反射强度的变化，从而测定蛋白质的存在和含量。
在一个优选的具体实施方案中，本发明涉及可用于蛋白质检测及定量的干式分析单元，包括(i)一层多孔铺展层，(ii)与多孔铺展层液体接触的一层或多层其它的层，和(iii)载体，其中所述单元在至少一层中包含含有丙烯酰胺的聚合物，并且其中所述单元包含一种具有下式结构的羟基羧酸，
其中R1和R2独立地为H、-CH3、-CH2CH3或-CH2OH，M为H，或带正电金属离子或非金属抗衡离子，而且进一步含有指示剂染料和钼酸根离子，它们在所述单元与被推测含有蛋白质的液体接触时，发生反应产生染料的光吸收或反射强度可测定的变化，并且其中所述染料，所述钼酸盐和所述含有丙烯酰胺的聚合物以及所述羟基羧酸可以一起存在于同一层中，或者以任何混合的形式或单独存在于所述单元的各层中。
本发明提供了一种使用上述优选的干式分析单元检测和定量蛋白质的方法，包括(A)将被推测含有蛋白质的液体样品与所述分析单元接触；(B)作为对蛋白质的存在和含量的检测，测定光吸收或反射强度的变化。
本发明被有利地用来测定各种含水液体中蛋白质的存在和/或浓度，例如人和动物的生物液体，食物，工业或城市排放物，以及通常用这种方法来检测的其他液体。能被检测的生物液体包括，但并非仅限于，全血、血清、血浆、尿液、脊髓液、泪液、关节滑液、淋巴液、组织或菌斑的悬液、齿龈残液、阴道液、颅内液以及对本领域熟练人员显而易见的其他液体。
能被测定的蛋白质包括，但并非仅限于，肽、多肽、蛋白质(例如酶、抗体、脂蛋白和糖蛋白)、以及包含或与肽、多肽和/或蛋白质连接(共价或非共价地)的化合物。本发明尤其可用于测定尿样中的蛋白。
使用包含多孔铺展层，通常为对所容纳的稀释或未稀释的测试样品(例如1～50μL)具有适宜多孔性的涂层的分析单元来完成本发明。采用本领域熟知的方法组装本发明的单元。优选地，该多孔铺展层为各向同性的多孔，其中该特性由层的颗粒，纤维或其它物理成分之间的互连空间提供。各向同性的多孔是指液体均匀地铺展在整个层上。可用于这些层的材料为水不溶性的并且在分析中保持它们的结构完整性。用于组装该单元的常规材料及方法描述在，例如，Przybylowicz等人的美国专利US3992158，Pierce等人的美国专利US4258001，Kitazima等人的美国专利US4292272以及Koyoma等人的美国专利US4430436，其全部内容在此引入作为参考。如Przybylowicz等人的美国专利US3992158所描述，该优选的多孔铺展层用硫酸钡(ESTANE)制备。
单元中具有一层或多层其它的层，它们均与多孔铺展层液体接触。应理解本文使用的术语“液体接触”指液体能很容易地从一层移动到另一层。这些其它的层，优选涂布的聚合物层，包括辅助剂(sub)、反应试剂和放射阻断层，并由一种或多种本领域熟知的亲水性黏合剂材料组成，例如明胶和乙烯基吡咯烷酮聚合物。一些层可为水不溶性而其他层可为水溶性的。
本发明中单元的各层能够自承重，但优选，这些层附着在适宜尺寸的稳定，化学惰性载体上。优选地，载体为非多孔性的且为电磁辐射可穿透的。选择的载体应该与打算选用的检测方式(例如，透射或反射光谱学)相配。可用的载体材料包括，但并非仅限于，纸，金属箔，聚苯乙烯，聚酯，聚碳酸酯和纤维素酯。
在本发明单元的至少一层中是能特异性地与蛋白质和钼酸根离子反应的染料。
如本文所采用的，“与蛋白质和钼酸根离子反应的染料”是指任意一种染料化合物，其中在钼酸根离子和蛋白质存在时，染料的光谱或光吸收性质不同于不存在蛋白质时的染料和钼酸根离子的光谱或光吸收性质。具有上述所需特性的染料包括含有开放式(open)芳族结构和具有能与钼酸根离子配位结合的官能团(例如，但不仅限于这些，位于芳香环上的两个相邻羟基)的三环芳族结构的那些。这些染料包括但不限于邻苯二酚紫、四溴苯酚酞乙基酯、三碘酚磺酞、四溴焦棓酚红，焦棓酚红。
在本发明的优选实施例中，提供了一种用于测定蛋白质存在和/或含量的多层分析单元。具体地说，该多层分析单元包括一层非孔载体，在其上具有液体接触的(i)第一试剂或缓冲液层，包括与蛋白质和钼酸根离子反应的染料，钼酸盐，含有丙烯酰胺的聚合物，(ii)内(sub)层，以及(iii)多孔铺展层。
本发明的单元可在适宜层中包括如本领域已知的有助于制备，液体铺展及吸收不需要的辐射的各种添加物。
本发明的单元可采用现有技术中描述的常规的涂布方法和装置(包括凹板、幕涂，漏斗和其他的涂布方法)来制备。该单元能被制成各种形状，包括任何所需宽度的长带、片层、切片或小片。进一步，本发明的方法可使用合适的分析装置和步骤人工操作或自动进行。通常，该方法包括通过把待检样品(例如，1～50μL)点样于多孔铺展层上来与单元中的反应试剂接触。单元中的液体的移动有效地混合试剂从而使反应得以进行。
加入样品后，把单元置于任何可望加快或其它有利于蛋白-染料-钼酸盐络合物形成的条件下，例如保温、加热或其他方法。
如上所述，本发明采用的与蛋白质和钼酸根离子反应的染料，包括但不仅限于含有开放式芳族结构和具有能与钼酸根离子配位结合的官能团(例如，但不仅限于，芳环上的两个相邻羟基)的三环芳族结构的那些。这些染料包括但不限于邻苯二酚紫，四溴苯酚酞乙基酯，三碘酚磺酞，四溴焦棓酚红和焦棓酚红。
上述确定的染料化合物可以从熟知的化学品供应商处购得，例如Eastman有机化学公司，Aldrich化学公司，Sigma化学公司等，或者可使用本领域技术人员熟知的常规的起始原料和方法来制备。
制备分别包含下述指示剂染料的干式分析单元邻苯二酚紫(邻苯二酚紫，4，4’-(3H-2，1-苯并氧硫杂戊烷(benzoxathiol)-3-亚基)-二-S，S-二氧化物)，焦棓酚红(2-(4，5，6-三羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯磺酸)，溴焦棓酚红(螺环(3H-2，1-苯并氧硫杂戊烷-3’，9’-[9H]-呫吨-3’，4’，5’，6’-呋喃-2，7-二溴-I，I-二氧化物))，棓因(3’，4’，5’，6’-四羟基螺环[异苯并呋喃-1(3H)，9’-[9H]呫吨-3-酮)。干式分析单元的一般性质描述在Przybylowicz等人的美国专利US3992158以及Frank和Pierce的美国专利US4258001中。所有这些染料对物理—化学环境变化敏感。
我们已经发现可在干式分析单元中使用上面确定的染料结合钼酸根离子进行尿蛋白的定量分析。包含邻苯二酚紫与钼酸根离子的干式分析单元提供最佳分析检测敏感度(也就是说，在所需蛋白浓度范围内，高达300mg/dL时，反射强度的最佳变化)，并且对于含人白蛋白的制备溶液提供可重复的准确度。
我们出人意料的地发现在涂布于式单元各种试剂中所用的聚合物载体影响指示剂染料系统与不同蛋白质间的表观反应性，因此，所测定的光学信号的大小取决于存在的蛋白的类型。适用于本发明的聚合物起作用以均化光学信号，也就是说，聚合物发挥作用以减少用相同质量或重量的不同蛋白质所获得的测定的反射强度信号之间的差异。这是所希望的，因为不同的蛋白质类型可能在不同的样本中站主导地位，并且所希望的测定是每单位体积样品中存在的蛋白质的总量(总蛋白)。理想地，对总蛋白的分析应定量具有相同敏感性的所有蛋白质。本发明的聚合物包括，但不仅限于，水溶性的均聚物，共聚物和三聚物，主要包括(重量百分比大于约40％)丙烯酰胺。若在本发明的聚合物中存在，能配位结合结合钼酸根离子的官能团必须不以干扰蛋白质测定的量存在。优选的聚合物是丙烯酰胺的均聚物，即，具有平均分子量为约20,000～250,000道尔顿的聚丙烯酰胺(下文称为PloyA)。最优选的范围为约100,000～150,000道尔顿。
此外，我们非常出人意料地发现将羟基乙酸加入到多层分析单元上(优选被预涂布在单元上)显著降低由于碳酸氢盐的干扰。具有下面结构式的其他羟基羧酸具有类似的效果并适用于本发明。
其中R1和R2独立的为H、-CH3、-CH2CH3或-CH2OH，M为H，或带正电金属离子或非金属抗衡离子。具有上述结构式的代表性的羟基羧酸包括2-羟基丙酸、2-甲基-2-羟基丙酸及其盐。
可使用包含指示剂染料和与上述丙烯酰胺聚合物结合的钼酸根离子以及羟基羧酸的干式分析单元而获得对尿蛋白的令人满意的定量分析。邻苯二酚紫与钼酸根离子以及混合的聚丙烯酰胺聚合物和羟基乙酸是优选的干式分析单元，其中所述聚丙烯酰胺聚合物具有大约20,000～250,000道尔顿的平均分子量，它提供高达300mg/dL的蛋白质浓度的灵敏测定和很好的可重复准确性。最优选的干式分析单元包括作为涂布在试剂/缓冲液层上的聚合物载体的PloyA(具有约100,000～150,000道尔顿的平均分子量)和预涂布的羟基乙酸。
聚丙烯酰胺起作用以均化指示剂染料邻苯二酚紫/钼酸根离子系统与不同蛋白质的反应性。在使用优选聚合物的干式单元中，相同质量浓度，不同种类的蛋白质的反射强度信号的差异被显著降低。使用其他种类指示剂染料和金属离子观察到使用邻苯二酚紫和钼酸根离子的聚合物的效果。本发明能制备一种用于定量具有约5～300mg/dL范围的尿总蛋白的干式分析单元。该干式单元对不同的蛋白质有近乎相同的敏感度，产生适宜于其所希望用途的准确性，并且优于现有技术中的溶液测定和基于干式单元的测定方法。通过在采用邻苯二酚/钼酸盐化合物的干式单元中加入羟基乙酸已克服了由于尿样中宽及变化的碳酸氢盐水平所导致的主要干扰。其他的羟基羧酸，例如上面公开的，无论是被加入单元还是与样本一起加入，都将具有类似的效果。这两个极不相同且出乎意料的发现提供了一种敏感且耐用的，特别适合于定量液体样品中总蛋白的干式分析单元。
提供以下实施例以说明本发明的范围。因为给出这些实施例只是为了说明的目的，所以其中包含的本发明不应限于此。除指出之外，所有试剂和设备均从商业来源获得。
以下实施例1-4描述了比较包括不同指示剂染料的单元的分析检测敏感度和可重复准确性的实验结果。实施例1邻苯二酚紫以0.12g/m2的量将邻苯二酚紫涂布于试剂层上，其中该试剂层另外包含12g/m2的具有下列组成的丙烯酰胺聚合物(聚(丙烯酰胺-共聚-N-乙烯基-2-吡咯烷酮，重量比为50∶50))，以下称为聚合物AVP来表示、表面活性剂ZonylFSN(0.36g/m2)和作为缓冲液的5.9g/m2丁二酸(pH2.5)，钼酸铵(0.18g/m2)及0.15g/m2的草酸钾。采用颗粒铺展层(具有下述组成且如US4258001所描述)。在铺展层和试剂层之间是聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)内层。将单元切成边长为1厘米的正方形并置于载片上。用Johnson和Johnson临床诊断载片分析仪将含蛋白质的溶液滴加到片状单元上，温育载片并读取反射强度值，Dr。这种评估单元的方法让操作者能检测多个单元并方便地获得重复的测量值。任何其他点样、温育和测量光学信号的方法也都适宜于评估干式单元。单元结构如下所示邻苯二酚紫单元铺展层30μm微珠 共聚(乙烯基甲苯甲基丙烯酸)内层 聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)共聚(丙烯酰胺-共聚-N-乙烯基-2-吡咯烷酮)(50∶50)wt邻苯二酚紫丁二酸试剂层钼酸铵草酸钾Zonyl FSN载体在670nm下测量Dr。下面的表1显示使用上述邻苯二酚单元获得的结果。通过向已知体积0.15M氯化钠的水溶液中加入已知重量的人血清白蛋白以获得具有表1所示的白蛋白浓度的液体来制备含有蛋白质的液体。将一等份(10μL)含白蛋白的液体加至单元的铺展层上。然后把已滴加的单元37℃温育5分钟。接着测定反射强度。所测的Dr是六次重复测定(n＝6)的平均值(<Dr>)。％CV是平均Dr的变异系数表1HSA(mg/dL) <Dr> ％CV10 1.0224.850 1.2091.01001.3702.31501.4891.93001.7324.7如通过10～300mg/dL白蛋白的反射强度变化(ΔDr＝0.710)所测定的，邻苯二酚单元的检测敏感性非常好。％CV’相对小，这表明良好的重复准确性。实施例2焦棓酚红如US3992158所描述的，把焦棓酚红以0.18g/m2的量涂布于硫酸钡铺展层层上。将表面活性剂TRITON X-100(0.001g/m2)，酒石酸(6.0g/m2，pH2.5)和草酸(2g/m2)涂布于10g/m2的覆盖度使用丙烯酰胺均聚物，polyA(具有100,000道尔顿的平均分子量)的试剂层上。以0.9g/m2的量将钼酸铵涂布于硫酸钡铺展层上。将聚(N-异丙基丙烯酰胺)内层涂布在涂布层和试剂层之间。单元结构如下所示焦棓酚红单元硫酸钡铺展层 焦棓酚红钼酸铵内层 聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚丙烯酰胺(polyA)试剂层 酒石酸乙二酸TRITON X-100Estar载体在pH2.5下涂布几种缓冲液，然而在所测的蛋白质浓度范围内，酒石酸提供最强的线性响应(在540nm处)。除在540nm波长下测量Dr值外，实验方法与对邻苯二酚紫单元所述的相同。结果(n＝6)示于表2。
表2HAS(mg/dL)<Dr> ％CV100 0.281 5.050 0.327 4.9150 0.363 7.1300 0.382 4.4在所测试的白蛋白浓度范围内，使用焦棓酚红单元的Dr的变化为0.101，因此，检测的敏感度低于使用邻苯二酚紫单元所获得的敏感度。％CV’值低，但至少大于使用邻苯二酚紫单元测得的值。实施例3溴焦棓酚红单元以0.24g/m2的量将溴焦棓酚红涂布于试剂层上，其中该试剂层包括12g/m2的聚丙烯酰胺载体，下文称为聚合物AAM(聚(丙烯酰胺-共聚-N-(3-乙酰乙酰氨基丙基)甲基丙烯酰胺)，重量比为95∶5)。表面活性剂TRITON X-165(0.20g/m2)，丙二酸(8.0g/m2，pH2.5)和钼酸铵(0.4g/m2)也被涂布在AAM层上。硫酸钡铺展层被涂布在聚(N-异丙基丙烯酰胺)内层上。包含硫酸钡铺展层的单元的结构如下所示溴焦棓酚红单元铺展层 硫酸钡内层聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚(丙烯酰胺-共聚-N-(3-试剂层 溴焦棓酚红丙二酸钼酸铵草酸钾双乙烯基磺酰甲基醚(BVSME)Estar基层如上对包含邻苯二酚和焦棓酚红指示剂染料的单元所述地评价溴焦棓酚红单元。来自溴焦棓酚红单元的评价数据见于表3表3HSA(mg/dL) <Dr> ％CV101.48286.1501.48720.6100 1.54711.3300 1.6602.6白蛋白浓度范围内的Dr的变化为0.178，因此，它提供比邻苯二酚紫单元低的检测敏感度。％CV’大，表明显著的重复不准确性。实施例4棓因以0.12g/m2的量将棓因涂布在硫酸钡铺展层上。将表面活性剂TRITON X-165(0.2g/m2)，丙二酸(8.0g/m2，pH2.5)和草酸(2.5g/m2)涂布在下文被称为聚合物AVP的共聚物上以形成缓冲液层，其中该共聚物为10.0g/m2的量，具有聚(丙烯酰胺-共聚-N-乙烯基-吡咯烷酮)(50∶50)wt的分子组成。除染料外，将钼酸铵(0.90g/m2)和表面活性剂TRITON X-100(1g/m2)涂布在硫酸钡铺展层上。该单元的结构如下所示棓因单元硫酸钡铺展层棓因钼酸铵TRITON X-100内层 聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚(丙烯酰胺-共聚-N-乙烯基-2-吡咯烷酮)(50∶50)wt缓冲液层丙二酸TRITONX-165草酸Estar载体如上对其他单元(n＝6)所述地评价棓因单元，并在波长550nm处测定Dr。结果提供在表4中。
表4HAS(mg/dL) <Dr> ％CV10 0.541 85.750 0.569 20.3100 0.565 93.1300 0.580 19.5白蛋白浓度范围内的Dr的变化值0.0379，与邻苯二酚单元相比，提供显著降低的检测敏感度。％CV’很大，表明显著的重复不准确性。
在本实施例中检测不同试剂层聚合物载体对使用包含邻苯二酚紫，优选染料，和钼酸铵的干式分析单元测定不同蛋白质类型的影响。在本实验中比较的聚合物为polyA(具有约120,000道尔顿的平均分子量)，(聚(丙烯酰胺-共聚-N-乙烯基-2-吡咯烷酮，重量比为50∶50)(聚合物AVP)和具有分子组成(聚(丙烯酰胺-共聚-丙烯酸，重量比为90/10))的下文称为聚合物PAA的聚合物。如前述的美国专利US3992156所描述的，在所有情况下铺展层均为硫酸钡。以相同的干式覆盖度(12g/m2)涂布聚合物。通过向已知体积的含0.15M氯化钠的水溶液中加入已知重量的感兴趣的纯化的人蛋白来制备包含蛋白质的溶液，其中这些令人感兴趣的蛋白质包括IgG，维生素A结合蛋白和κ轻链。如上所述，单元被制成片状。使用含纯化的人白蛋白的溶液(以下称为校准液)进行测定的校准。将10μL各种含100mg/dL待测蛋白质的等份试样分别滴加到各个干式分析(片状)单元上。37℃下将载片温育5分钟后，在670nm处测量反射强度。从测得的反射强度计算样品中总蛋白水平并用上述的校准液进行测定的校准。结果示于表5中。
表5聚合物类型对蛋白质反应性的影响白蛋白 κ轻链 λ轻链 IgG， 维生素A α1微球结合蛋蛋白聚合物白mg/dLmg/dLmg/dL mg/dL mg/dL mg/dLAVP 100 33 33 64 62 44polyA100 44 52 73 73 66PAA 100N.D.**34 59N.D.** N.D.****未检测表5中的数据表明聚合物影响邻苯二酚和钼酸根离子与蛋白质的相互作用。尤其是，polyA起作用以减小从不同种类蛋白质所观察的Dr值的差异，因此，根据使用含人白蛋白的液体的校准确定所估测的蛋白浓度。根据加入到液体中的蛋白质的量，这导致蛋白浓度估计值接近所希望的100mg/dL。显然，最好的结果，即根据测试的蛋白质类型，所检测的信号的最小的依赖性是由polyA提供的。实施例6在本实施例中，评估了羟基乙酸对碳酸氢盐干扰的影响。将羟基乙酸预涂布在还以12g/m2的量含有polyA的试剂层上。以如表6所示水平将羟基乙酸涂布在试剂层中。向收集的人尿样中加入碳酸氢钠以获得为100mM或200mM的碳酸氢盐最终浓度(在两种情况下，最终收集的尿样pH＝8.5)。该pH值未被调至最终的观察值，而是加入碳酸氢盐后产生的pH值。未处理的尿样收集对照组的总蛋白为18mg/dL(使用用于测定总蛋白的BIOTROLTM试剂盒测定，它是一种使用焦棓酚红/钼酸铵染料结合方法，可从Merck Biotrol Diagnostics，Exton，PA 19341；目录号A01217U获得的溶液基分析试剂盒)。如上面实施5来测定射强度，并用如实施例5的含人白蛋白的液体作为校准液对分析单元校准后，使用测得的Dr值来估算总蛋白浓度。从由碳酸氢盐处理过的尿样所获得的蛋白质估算值中减去对照尿样所获得蛋白质的估算值。数据示于表6中。
表6羟基乙酸对碳酸氢盐干扰的影响经碳酸氢盐处理和无碳酸氢盐的对照组之间的蛋白质浓度的差异羟基乙酸 碳酸氢盐g/m2100mM 200mM0 35 1100.125 22 770.25 13 540.375 8 300.54 200.75 N.D. 131.0N.D. -2(N.D.＝未测定)碳酸氢盐起作用以产生模拟蛋白质的光学信号。例如，在不存在羟基乙酸时，具有200mM碳酸氢盐浓度的尿样的所估算的蛋白质浓度比实际水平高出约110mg/dL。如表6所示，羟基乙酸显著减小碳酸氢盐的影响。羟基乙酸(或为其他合适的羟基羧酸，如前所述)可被如实施例6那样直接加入到干式分析单元中，或用另外的方式，在干式分析单元与样品接触前加入到样品中。涂布在单元中的羟基乙酸的有效浓度范围为约0.125～2.0g/m2。优选范围为0.125～1.5g/m2，较优选的范围为0.25～1.25g/m2。优选的干式分析单元的结构如下所示铺展层 硫酸钡内层 聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚丙烯酰胺(polyA)羟基乙酸邻苯二酚紫染料钼酸铵试剂/缓冲液层 草酸钾Zonyl-FSN表面活性剂丙二酸缓冲液，pH＝2.5载体提供上述实验和实施例以说明本发明的范围和实质。这些具体实施方案和实施例以及其它具体实施方案和实施例对于本领域的技术人员是显而易见。这些其他的具体实施方案和实施例在本发明的设想之内；因此，本发明应仅由所附权利要求来限制。
权利要求
1.一种测定蛋白质的干式分析单元，所述单元包括(A)一层多孔铺展层；(B)一层或多层其它的层，包括(i)一种能与蛋白质和钼酸根离子反应而引起所述染料的光吸收或反射强度变化的染料；(ii)一种钼酸盐；和(iii)一种包含丙烯酰胺的聚合物，其中所述染料，所述钼酸盐和所述包括丙烯酰胺的聚合物可一起存在于同一层中，或者以任何混合的形式或单独存在于所述单元的各层中；(C)一种载体。
2.权利要求1中的干式分析单元，其中所述染料选自邻苯二酚紫，焦棓酚红，溴焦棓酚红和棓因。
3.权利要求2中的干式分析单元，其中所述染料为邻苯二酚紫。
4.权利要求1中的干式分析单元，其中所述钼酸盐为钼酸铵。
5.权利要求1中的干式分析单元，其中所述包含丙烯酰胺的聚合物选自polyA，聚合物AVP，聚合物PAA和聚合物AAM。
6.权利要求1中的干式分析单元，其中所述染料为邻苯二酚紫，所述钼酸盐为钼酸铵和所述包括丙烯酰胺的聚合物为具有100,000～150,000道尔顿分子量范围的polyA。
7.权利要求6的干式分析单元，其中所述多孔铺展层包含硫酸钡。
8.一种测定蛋白质的方法，包括(A)将被推测含有蛋白质的液体与具有下面结构通式的羟基羧酸混合
其中R1和R2独立地为H、-CH3、-CH2CH3或-CH2OH，、并且M为H，或带正电金属离子或非金属抗衡离子；(B)将包含所述羟基羧酸并被推测含有蛋白质的所述液体与干式分析单元混合，所述单元包括(a)一层多孔铺展层，(b)与所述多孔铺展层液体接触的一层或多层其它的层，包括(i)一种能与蛋白质和钼酸根离子反应引起所述染料的光吸收或反射强度变化的染料；(ii)一种钼酸盐；(iii)一种包含丙烯酰胺的聚合物，其中所述染料，所述钼酸盐和所述包括丙烯酰胺的聚合物可一起存在于同一层中，或者以任何混合的形式或单独存在于所述单元的各层中；(c)一种载体；和(C)测定染料的光吸收或反射强度的变化，从而对蛋白质进行测定。
9.一种测定蛋白质的干式分析单元，所述单元包括(A)一层多孔铺展层(B)与所述多孔铺展层液体接触的一层或多层其它的层，包括(i)一种能与蛋白质和钼酸根离子反应引起所述染料的光吸收或反射强度变化的染料；(ii)一种钼酸盐；(iii)一种包含丙烯酰胺的聚合物；(iv)具有下面结构通式的羟基羧酸
其中R1和R2独立地为H、-CH3、-CH2CH3或-CH2OH，并且M为H，或带正电金属离子或非金属抗衡离子，其中所述染料，所述钼酸盐，所述包含丙烯酰胺的聚合物和所述羟基羧酸可一起存在于同一层中，或者以任何混合的形式或单独存在于所述单元的各层中；和(C)一种载体。
10.一种测定蛋白质的方法，包括(A)让被推测含有蛋白质的液体样品与干式分析单元接触，其中该干式分析单元包括(a)一层多孔铺展层；(b)与所述多孔铺展层液体接触的一层或多层其它的层，包括(i)一种能与蛋白质和钼酸根离子反应引起所述染料的光吸收或反射强度变化的染料；(ii)一种钼酸盐；(iii)一种包含丙烯酰胺的聚合物，(iv)具有下面结构通式的羟基羧酸
其中R1和R2独立地为H、-CH3、-CH2CH3或-CH2OH，并且M为H，或带正电金属离子或非金属抗衡离子，其中所述染料，所述钼酸盐，所述包含丙烯酰胺的聚合物和所述羟基羧酸可一起存在于同一层中，或者以任何混合的形式或单独存在于所述单元的各层中；(c)一种载体；和(B)测定染料的光吸收或反射强度的变化，从而对蛋白质进行测定。
全文摘要
公开了一种能被用来灵敏快速地检测和定量蛋白质的干式分析单元。该测定通过使用一种能与蛋白质和钼酸根离子反应引起所述染料的光吸收可检测的变化的染料来进行。另外还公开了稳定和提高测定精确度的聚合物以及减小碳酸氢盐干扰的化合物。
文档编号G01N33/68GK1240937SQ9910762
公开日2000年1月12日 申请日期1999年4月24日 优先权日1999年4月24日
发明者T·阿特尔, D·B·拉塔特, J·C·毛克, R·C·苏顿, W·维伯, R·温特科尔恩, J·谢菲尔 申请人:奥索临床诊断有限公司