一种改进的冰冻切片方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织样本制备及病理研究领域，具体涉及一种制备组织样品的改进的冰冻切片方法及其应用。
【背景技术】
[0002]随着人类以及其它物种基因组测序的逐步完成，现代生物学的研究已经进入了后基因组时代一功能基因组时代。随着功能基因组发展的需要，针对不同生物大分子研究的高通量技术陆续发展，包括基因组技术，转录组技术，蛋白质组技术等。近年来，针对少量甚至单细胞样品的各种组学方法也开始发展并得到应用。随着海量数据处理和分析的需要，生物信息学也发展迅速。同时，在组织样品的分选方面，随着激光显微切割技术的应用，使得对于特定的组织类型和细胞类型的分选成为可能。这两方面技术发展的结合，使得在组织层面上进行系统生物学研究成为可能，对于现代分子病理学而言，也是一场革命性的变化。研究者将有可能根据研究的需要，分选出特定的组织结构或者细胞类型，进行全基因组尺度的定量测量和分析，从而对机体的正常发育和异常病变的分子机制有全面的深入理解，对疾病的预防和治疗提供重要的理论基础。
[0003]基于组织形貌或者细胞类型的组学研究，主要的流程是:对要研究的临床组织样品或者模式动物组织样品进行切片和染色，找到目标组织结构或者细胞类型，利用激光分选技术分选出目标组织或者细胞类型，根据研究目的提取DNA、RNA或者蛋白，对少量样品放大之后，利用高通量技术(例如基因芯片、二代测序技术或者蛋白质组学等方法)对样品内的生物分子进行全基因组尺度的定量分析。在样品的制备方面，进行这类研究的必要条件是在找到特定组织或者细胞结构的同时，保持高质量的生物分子结构。
[0004]目前组织样品的制样方法主要有三类，一类是石蜡切片，一类是冰冻切片，一类是固定冰冻切片。这三种方法各有优缺点。石蜡切片的基本流程是新鲜样品固定，脱水，树脂渗透和聚合，然后进行切片。切片好之后进行脱蜡，染色，进行下游的分子生物学操作。石蜡切片的优点是切片比较薄，固定之后的样品能保持比较好的组织学形貌。缺点是生物大分子的质量，特别是RNA和蛋白的质量和抽提效率比较差，一般难以进行全基因组的分析。冰冻切片样品的基本流程是将新鲜样品直接用液氮速冻，进行冰冻切片，染色，然后进行下游的分子生物学研究。该方法的优点是能保持好的RNA质量，缺点是组织结构的形貌保持较差，形态辨认困难。固定冰冻切片的基本流程是将新鲜样品固定，直接进行冰冻切片，染色，然后进行下游的分子生物学研究。该方法的优点是能保持较好的形貌，抗原的空间结构保持较好，缺点是，虽然生物大分子的质量较石蜡切片有所改善，但是还是不足以满足大规模分析的样品质量要求。这两类冰冻切片方法对于含水量大，体积也较大的组织，由于细胞内容易形成冰晶的问题，样品结构保持非常差，不能满足结构或者细胞形态分辨的要求。
[0005]因此，目前系统生物学和分子病理学发展需要，急需一种既能完整保持组织结构，又能保持高质量的生物大分子的组织样品制备方法。
[0006]在优化组织样品制备方法上，研究人员对于样品的固定剂选择和样品的包埋方式等做了一系列的尝试。在组织样品的制备中，固定剂的选择和使用对后期样品形貌和生物大分子质量影响最大。研究人员尝试了不同固定剂的使用，例如Melissa L.Cox等人考察了不同的固定剂 70%neutral_buffered formal in, modified Davidson’s II, 70%ethanol,UMFIX, modified CarnoyJ s, modified methacarn,Bouin’ s,phosphate-buffered saline和30%sucrose对于组织样品形貌和RNA质量的影响。在这些固定剂中，虽然modifiedmethacarn 能一定程度提高RNA 的质量。Mark A.Perlmutter, John ff.Gillespie 等人用 70%的乙醇温和固定组织样品，然后进行石蜡包埋，这种方法能保持组织的精细结构，并适当提高RNA的质量。VaskerBhattacherjee等人利用预冷的4%多聚甲醒(paraformaldehyde)对组织进行短时间固定，然后进行冰冻切片。经过这些尝试，虽然样品一定程度地提到了 RNA的质量，但是总体上来说，RNA的质量还是不能满足对于高通量测序的要求。另外，用液氮预冷的异戊烷也被用于组织样品的直接速冻，但是对于含水量大的大样品，该方法还是不能保持精细的组织结构。
[0007]生物试剂公司也开发了相应的商业试剂盒，试图提高临床生物样品的生物大分子质量。例如，Qiagen公司开发了 Allprotect Tissue Reagent试剂盒,该试剂盒可在室温下立即稳定组织样本中的DNA、RNA和蛋白质。这样可以稳定DNA、RNA和蛋白质，以保证可靠的下游分析。稳定后的组织可在15-25°C运输7天，2-8°C储存长达12个月，在-20°C或_80°C可储存更长时间。但是商业试剂盒还不能完整保持组织的精细结构。
[0008]从上面的分析来看，目前样品制备技术已经成为系统生物学发展的一个关键技术瓶颈，另外分子病理学的科学和临床研究，以及生物样本库的建设，都急需一种通用、简易的组织样品处理方法，这种方法要既能保持很好的组织精细结构，同时又能保持高质量的生物大分子质量，以满足科研和临床的需求。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能同时保持组织精细结构和细胞内生物大分子(DNA,RNA和蛋白)完整性的通用型组织制备方法，具体的，为一种改进的冰冻切片技术。
[0010]本发明首先公开了一种改进的冰冻切片方法，包括组织预处理步骤、组织包埋步骤，组织冰冻以及切片步骤，切片步骤后获得冰冻组织切片；本发明所述组织预处理步骤为采用冰冻保护剂对组织样品进行浸泡处理。
[0011]进一步的，本发明所述改进的冰冻切片方法不包括切片固定步骤。
[0012]具体的，所述改进的冰冻切片方法，包括以下步骤:
[0013]I)预处理:将组织样品放入冰冻保护剂中进行浸泡，使冰冻保护剂浸入组织样品;
[0014]2)样品包埋:将预处理后的组织样品放入冰冻切片包埋剂中浸泡，然后采用冰冻切片包埋剂包埋；
[0015]3)冰冻及切片:将包埋后的样品冻存后切片，获得冰冻组织切片。
[0016]优选的，在预处理前采用事先在冰上预冷的0.0lM PBS溶液对新鲜取下来的组织样品进行清洗，然后用无尘吸水纸吸干表面水分。
[0017]较优的，所述冰冻保护剂为二甲基亚砜(DMSO)溶液。
[0018]优选的，所述冰冻保护剂为5?40wt%的二甲基亚砜溶液。
[0019]更优的，所述冰冻保护剂为10?30wt%的二甲基亚砜溶液。
[0020]最优的，所述冰冻保护剂为20wt%的二甲基亚砜溶液。
[0021]优选的，所述二甲基亚砜(DMSO)溶液的溶剂选自水，5?75v/v%乙醇水溶液，或者与组织等渗的缓冲溶液。
[0022]更优选的，所述乙醇水溶液为20v/v%乙醇水溶液。更优选的，所述与组织等渗的缓冲溶液的pH值为6.8?7.5。最优选的，所述与组织等渗的缓冲溶液为PBS缓冲溶液或HBSS缓冲溶液。
[0023]优选的，步骤I)所述冰冻保护剂浸泡的温度条件为O?28°C。更优选的，所述冰冻保护剂浸泡的温度条件为4?25°C。最优的，所述冰冻保护剂的浸泡温度条件为4±2°C。
[0024]在冷冻保护剂中的浸泡时间具体根据样品大小决定，以完全渗透样品组织为佳。优选的，冰冻保护剂的浸泡时间为1min以上。更优选的，冰冻保护剂的浸泡时间为0.5?3h。
[0025]较优的，步骤2)中所述冰冻切片包埋剂的处理温度条件为O?28°C。更优的，所述冰冻切片包埋剂的处理温度条件为4?25°C。最优的，所述冰冻切片包埋剂的处理温度条件为4±2°C。
[0026]在包埋剂中浸泡时间的选择属于本领域常规技术手段，具体根据样品大小决定处理时间。优选的，所述冰冻切片包埋剂的浸泡时间为0.5h以上。更优选的，所述冰冻切片包埋剂的浸泡时间为I?6h。
[0027]较优的，所述冰冻切片包埋剂为OCT包埋剂。
[0028]优选的，步骤3)切片的厚度为6?18 μ m。
[0029]步骤3)所述冻存为现有技术，例如液氮速冻或者_80°C冷冻过夜；或者，步骤3)的冰冻及切片步骤可采用现有的冰冻切片机实现。
[0030]并且，本发明改进的冰冻切片技术适用于任何组织；特别适用于含水量较大的人体和动物组织，例如人和动物胚胎组织，人和动物的肾组织等；也适用于脂质含量较高的组织，如人和动物的脑组织等。
[0031]较优的，前述改进的冰冻切片方法中，所述组织为含水量超过40wt%的组织，和/或脂质含量超过10wt%的组织。
[0032]更优的，前述改进的冰冻切片方法中，所述组织为含水量超过60wt%的组织，和/或脂质含量超过35wt%的组织。
[0033]现有技术可知，含水量超过60wt%的组织可以选自例如胚胎、肾组织等；脂质含量超过35wt%的组织包括脑组织等。最优的，前述改进的冰冻切片方法中，所述组织选自胚胎、脑组织或肾组织。
[0034]采用本发明方法制备的组织样品冰冻切片可以不经过固定步骤，直接用于组织染色、显微观察，以及其他分子生物学实验