，特别是在全基因组尺度对DNA，RNA和蛋白组分和结构的分析。弥补了常用的固定处理无法保证DNA、RNA和蛋白质质量的缺点，解决了胚胎和脑组织无法快速直接进行冰冻切片并做下游分子生物学实验的难题。
[0035]本发明第二方面公开了前述改进的冰冻切片方法在提高切片精细组织结构，并同时保证组织样品中生物大分子质量中的应用。
[0036]优选的，所述生物大分子选自DNA、RNA以及蛋白质。所述大分子质量是指大分子的完整度和高级结构。
[0037]优选的，所述切片为含水量超过60wt%的组织的冰冻切片，和/或脂质含量超过35wt%的组织的冰冻切片。本法发明的组织均为离体组织。
[0038]即本发明还公开了前述改进的冰冻切片方法在制备含水量超过60wt°/c^P/或脂质含量超过35wt%的组织样品的冷冻切片中的应用。进一步的，为前述改进的冰冻切片方法在制备胚胎、脑组织或肾组织样品的冷冻切片中的应用。
[0039]本发明第三方面公开了冰冻保护剂在组织冰冻切片技术中的应用。
[0040]所述在冰冻切片技术中的应用为提高冰冻切片精细组织结构，并同时保证组织样品中生物大分子质量的应用。
[0041]优选的，所述冰冻保护剂为前述二甲基亚砜(DMSO)溶液。
[0042]本发明第四方面公开了一种制备高质量组织样品切片的方法，为采用冰冻保护剂对样品进行预处理，然后将预处理后的组织样品经冰冻切片包埋剂浸泡并包埋后，冻存并切片。
[0043]较优的，所述冰冻切片包埋剂为OCT包埋剂
[0044]本发明改进的冰冻切片方法通过先期冰冻保护剂的样品处理(如二甲基亚砜溶液，Dimethyl sulfoxide, DMS0)，对组织进行渗透处理，然后用冰冻切片包埋剂(如0CT)进行包埋，冰冻切片后染色观察组织的形貌，进行下游分子生物学研究。
[0045]采用本发明的组织样品制备方法的优点:
[0046]I)该方法操作简单，所需的时间短，可以在常温下操作。所用的试剂例如DMSO和OCT包埋剂都是实验室常规使用，成本低廉。
[0047]2)样品无需任何组织固定剂，就能获得类似石蜡切片效果的精细组织结构，同时保证生物分子DNA、RNA和蛋白的高质量，满足下游对这些生物大分子的检测，特别是全基因组尺度的分析；并且本发明适用于所有的人和动物的组织，特别对含水量大，较软，体积大的难处理样品有效，满足肿瘤、发育生物学等科学研究和临床各类病理诊断的需求，同时可用于生物样本库的建设，应用前景广阔。
【附图说明】
[0048]图1:E15天小鼠胚胎4°C下经20%DMS0溶液(溶剂为20v/v%乙醇水溶液)和冰冻切片包埋剂处理，冰冻切片后H&E染色，腹上部(100 X )
[0049]图2:E15天小鼠胚胎4°C下经20%DMS0溶液(溶剂为20v/v%乙醇水溶液)和冰冻切片包埋剂处理，冰冻切片后H&E染色，腹下部(100 X )
[0050]图3:E15天小鼠胚胎4°C下经20%DMS0溶液(溶剂为20v/v%乙醇水溶液)和冰冻切片包埋剂处理后，冰冻切片后H&E染色，臀部(100 X )
[0051]图4:4°C下经20%DMS0溶液(溶剂为20v/v%乙醇水溶液)和冰冻切片包埋剂处理过的小鼠胚胎样品，其RNA经Agilent2100B1analyzer检测的结果。
[0052]图5:4°C下经20%DMS0溶液(溶剂为20v/v%乙醇水溶液)和冰冻切片包埋剂处理过的小鼠胚胎样品，其DNA经1.5%的琼脂糖凝胶电泳图。
[0053]图6:25°C下经10%DMS0水溶液和冰冻切片包埋剂处理过的小鼠肾组织，冰冻切片后HE染色(200X)
[0054]图7:25°C下经10%DMS0水溶液和冰冻切片包埋剂处理过的小鼠肾组织，其RNA经AgiIent210B1analyzer 检测的结果。
[0055]图8:0°C下经20%DMS0溶液(溶剂为HBSS溶液)和冰冻切片包埋剂处理过的小鼠脑组织，冰冻切片后HE染色(100 X )
[0056]图9:0°C下经20%DMS0溶液(溶剂为HBSS溶液)和冰冻切片包埋剂处理过的小鼠脑组织，冰冻切片后微管蛋白免疫染色(400 X )
[0057]图10:D38天人的胚胎样品4°C下经30%DMS0溶液(溶剂为PBS溶液)和冰冻切片包埋剂处理后，其RNA经Agilent2100B1analyzer检测的结果。
[0058]图11:D38天人的胚胎样品4°C下经30%DMS0溶液(溶剂为PBS溶液)和冰冻切片包埋剂处理后，冰冻切片后H&E染色(100 X )
[0059]图12:E14天小鼠胚胎样品直接液氮速冻后切片经HE染色(100 X )
[0060]图13:E14天小鼠胚胎样品直接经冰冻切片包埋剂包埋后液氮速冻，-80度过夜后切片经HE染色(100X)
[0061]图14:E14天小鼠胚胎样品经冰冻切片包埋剂浸泡2h，冰冻切片后HE染色(100X )
【具体实施方式】
[0062]下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0063]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比如无特别说明均为体积百分比浓度，所用金属器皿以及玻璃容器均已180°C烤过夜，所用塑料器材均为RNA级别。
[0064]试剂的配制以及生物样品的获取:
[0065]I) 0.1%DEPC水:取Iml DEPC注入到999ml ddH20中，磁力搅拌过夜至完全溶解，然后121 °C高压处理20min。
[0066]2) PBS 缓冲溶液:称取 8g NaCl, 0.2g KCl, 3.64g Na2HPO4.12H20 和 0.24g KH2P04,加0.1%DEPC水定容至1000ml，磁力搅拌至完全溶解后121°C高压20分钟。
[0067]3)HBSS 缓冲溶液:取 1g HBSS (Hanks’Balanced Salts, Sigma)溶解于 0.1%DEPC水，定容至1000ml。
[0068]实施例1改进的冰冻切片法在小鼠胚胎样品中的应用
[0069]胚胎样品是含水量很大，非常娇嫩的组织样品，对整个胚胎进行冰冻切片同时得到好的组织精细结构非常困难，本发明方法的应用成功获得完整胚胎的连续切片，组织结构保持完好，同时得到高质量的RNA，具体实验操作如下:
[0070]1.实验材料的冰冻切片处理步骤
[0071]I)取E15天(以雌雄小鼠合笼后观察到阴道栓的时间定为EO天)的小鼠胚胎，测其头臀长为15mm，在PBS溶液中清洗后用无尘吸水纸洗去表面水分，再于4°C 4ml20%DMS0溶液(溶剂为20v/v%乙醇水溶液)中浸泡1.5h，取出胚胎后用无尘吸水纸吸去表面水分，再放入4ml OCT包埋剂中于4°C浸泡3h。
[0072]2)经步骤I)处理后的胚胎再用新的OCT包埋剂进行包埋，并在冰冻切片机箱体内(_20°C)放置30分钟后再转到_80°C冰箱保存过夜。
[0073]3)将步骤2)中放置过夜的小鼠胚胎从_80°C取出进行冰冻切片，冻头温度_20°C，箱体温度_22°C，切片厚度14um。
[0074]2.冰冻切片的质量检测及结果
[0075]2.1收集2片本实施例步骤3)制备的冰冻切片，用RNeasy Micro Kit(购自QIAGEN公司)提取total RNA，经Agilent2100B1analyzer检测其RIN值为9.50 (结果可参见附图4)，表明经此方法处理的小鼠胚胎RNA质量很好。
[0076]2.2将本实施例步骤3)制备的冰冻切片进行贴片，从尾部到腹部再到头部，贴好的片子经95%的乙醇脱水3分钟后再常温进行HE染色，染好色的片子在在显微镜下观察形貌并拍照(参见附图1-3)，照片显示本发明冰冻切片方法获得的组织样品细胞形态完好，切片整体结构完整清晰。
[0077]2.3分别收集六片本实施例步骤3)制备的冰冻切片，用QIAamp DNA Micro Kit(购自QIAGEN公司)提DNA，其产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳的结果显示DNA质量完好，实验结果见附图5。
[0078]3.实验结论
[0079]胚胎样品是含水量特别大，常规冰冻切片方法不能处理的组织样品。本发明的切片方法能够适用于含水量大，较软的难处理样品，特别是胚胎样品；在保持组织精细结构的同时，还能保证细胞内生物大分子(RNA和DNA)的完整性。
[0080]实施例2改进的冰冻切片法在小鼠肾组织中的应用
[0081]本发明的方法不仅可以在含水量非常高的胚胎样品中应用，还适用于其它高含水量的组织，比如小鼠的肾，本实施例在小鼠肾组织上应用本发明方法，获得了很好的结果，具体实验方法如下。
[0082]1.实验材料的冰冻切片处理步骤
[0083]I)取小鼠的肾组织，放入PBS溶液中清洗后用无尘吸水纸吸去表面水分，再放入4mll0%的DMSO水溶液中于25°C浸泡30分钟后取出，用无尘吸水纸吸去表面液体，再放入OCT包埋剂中25°C浸泡2h。
[0084]2)经步骤I)处理的小鼠肾组织用新的OCT包埋剂