基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种测定蛋白质溶解度的方法，特别是涉及一种基于超声分散、差速 离心和光谱技术的蛋白质溶解度快速测定方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质作为有机大分子化合物，在水中以分散态（胶体态）存在，因此，蛋白质在 水中无严格意义上的溶解度，只是将蛋白质在水中的分散量或分散水平相应的称为蛋白质 的溶解度。
[0003] 蛋白质溶解度的大小在实际应用中非常重要，因为溶解度特性数据在确定天然蛋 白质的提取、分离和纯化时是非常有用的，蛋白质变性的程度也可以通过蛋白质的溶解行 为的变化作为评价指标。此外，蛋白质在饮料中的应用也与其溶解性能有直接的关系。
[0004] 蛋白质在溶液中的溶解情况，可以将其分为两种：无丁达尔现象和具有明显丁达 尔现象的蛋白质分散体。前者说明蛋白质在该溶液中的分散很好，分子基本上完全舒展 开；后者则是由于蛋白质分子在溶液体系中无法分散伸展开，以颗粒状或团聚体状存在，结 果其光散射性较好，出现明显的丁达尔现象。蛋白质溶解度的常用表示方法为蛋白质分散 指数（protein dispersibility index，PDI)、氮溶角军指数（nitrogen solubility index， NSI)、水可溶性氮（water soluble nitrogen，WSN)。
[0005] PDI =水分散蛋白/总蛋白
[0006] NSI =水溶解氮/总氮
[0007] WSN =可溶性氮的质量/样品的质量
[0008] 蛋白质溶解度的大小受到一些条件如PH值、离子强度、温度、溶剂类型等影响。蛋 白质的溶解度在等电点（Pi)时通常是最低的，pH值在高于或低于等电点时，蛋白质所带的 净电荷为负电荷或正电荷，其溶解度均增大。蛋白质的溶解度在Pi时虽然是最低的，但是 对不同的蛋白质，还是有一定差异。一些蛋白质如酪蛋白、大豆蛋白在等电点时几乎不容， 而乳清蛋白在等电点时的溶解度仍然很好。对于溶解性随PH值变化大的蛋白质，通过改变 介质的酸碱度对其进行相应的提取、分离是十分方便的；而对于溶解性随pH值变化不大的 蛋白质，则需要通过其他的方式才能达到分离、提纯的目的。
[0009] 盐类对蛋白质的溶解性也产生不同的影响。当中性盐的浓度范围为0.1 - Imol/ L时，可增大蛋白质在水中的溶解度（盐溶，salting in)，蛋白质的溶解性与离子强度有 关；而在中性盐的浓度大于lmol/L时，可降低蛋白质在水中的溶解度甚至产生沉淀（盐析， salting out)〇
[0010] Melander W 和 Horvath C 报道了 蛋白质的相图（Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins:an interpretation of the lyotropic series.Archives of biochemistry and biophysics，1977, 183(1) :200 - 215)，在该相图有三条线，三条线从下而上分别为溶解度 曲线、稳定度曲线和沉淀曲线，将相图分为四个区域，即不饱和区、亚稳区、不稳定区和沉淀 区，见附图1。
[0011] 从已知的方法来看，PDI、NSI值的确定很复杂。以确定NSI为例，文献（陈春佳，张 宝琴.大豆蛋白质NSI和roi的检测方法比较[J].西部粮油科技，2000, 25(5) :47 - 49.) 显示如下：称取5g样品（天平精确度0.0 lg)，放入500ml的烧杯中，量取200ml 30°C的蒸 馏水，分几次加入到样品中，样品混合后把烧杯浸在30°C的水槽中，用机械搅拌器在转速为 120r/min的条件下，搅拌混合物120min，然后把混合物转移到250ml的容量瓶中.用蒸馏 水稀释到刻度，放置几分钟后往50ml离心试管中倒入40ml试样，在1500r/min的转速下 离心10min，用带有玻璃纤维的漏斗过滤离心管中的上清液（不要把分离后的固体倒入过 滤器），把澄清滤液倒入100mL容量瓶中，移取25ml澄清液加入凯式烧瓶中，然后按AOCS Aa5 - 91测定水溶氮量及总氮量。由上述方法可以看出，其操作过程比较复杂，且最后要应 用凯氏测氮法，进行装置搭建和酸碱滴定等操作。
[0012] 已报道的测定蛋白质溶解度新方法包括：（I)Berg A等采用高通量筛选技术和 机器测量结合，以溶菌酶为例，测定蛋白质溶解度（Automated measurement of apparent protein solubility to rapidly assess complex parameter interactions[J]. Food and Bioproducts Processing. 2014, 92(2)，133 - 142) ;(2)Forsythe E L 等米用微液注 技术，以溶菌酶为例，测定蛋白质的溶解度（Tetragonal chicken egg white lysozyme solubility in sodium chloride solutions[J]. Journal of Chemical&Engineering Data，1999, 44(3) :637 - 640)。Berg A等测定的溶菌酶的溶解度曲线实际上是相图中的沉 淀曲线，即通过溶液中是否产生沉淀作为到达溶解度的标志，其测定原理是将溶菌酶溶于 NaCl水溶液形成不饱和的状态，即没有沉淀产生，然后蒸发溶液中的水分，直到其达到饱和 有沉淀生成为止。Forsythe E L等测得的溶菌酶的溶解度曲线是基本上相图中的溶解度曲 线，其测定方法是先制得溶菌酶的微晶，需要反复的结晶、溶解和重结晶，然后再通过微液 柱技术获得所能达到的热力学平衡数据，该方法操作较为复杂且耗时。上述两种方法测定 蛋白质溶解度的时间较长，微液注技术需要纯度较高的蛋白质晶体才能测定溶解度，同时 两种方法测得的溶解度数据相差较大，因为前者是测定蛋白质的沉淀曲线作为溶解度，而 后者是采用热力学平衡作为溶解度，但是都能满足实际应用。上述方法测定的蛋白质溶解 度均能达到化学和生物应用的要求，但相对复杂、耗时长。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是针对蛋白质溶解度测定的复杂性和不确定性，提供采用超声分 散、差速离心操作结合光谱分析技术，对蛋白质的溶解度进行稳定、快速、准确的测定。
[0014] 本发明通过提供一种较为简便、易行的方法测定蛋白质的溶解度，以便为蛋白质 的提取、分离、纯化和改性，以及蛋白质变性的程度提供一种比较简单的参考方法。
[0015] 本发明的原理如下：
[0016] 蛋白质加入溶剂体系中时，存在溶解平衡，而且溶解平衡需要较长时间才能达到。 蛋白质-溶剂多数情况下形成的稳定分散体系是胶体，而非溶液，即此时蛋白质小颗粒