一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于卷烟主流烟气中有害物质分析检测技术研究，具体涉及一种液相色 谱-串联质谱法检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物（AGEs)(包括羧甲基赖氨酸 (CML)和羧乙基赖氨酸（CEL))的方法。
【背景技术】
[0002] 晚期糖基化终末产物（AGEs)是糖和蛋白质或脂肪反应生成，在食品中主要存在于 高温加热烹制的食品。当AGEs含量较高时，人体免疫系统处于发炎状态，具有促进炎症、心 血管疾病、糖尿病和加速衰老等有害作用 [1]。目前研究最多的AGEs是羧甲基赖氨酸（CML) 和羧乙基赖氨酸（CEL)。AGEs的生成与美拉德反应有一定的关联，是还原糖和蛋白质、月旨 肪等反应形成的，中间产物为系列的席夫碱化合物和Amadori产物，之后形成更加稳定的 AGEs[2]。烟叶富含蛋白质和还原糖类化合物，在调制、陈化、加工以及燃吸过程中，都不同程 度地发生美拉德反应，生成多种烟草香味成分。卷烟在燃烧过程中，会发生美拉德反应，具 备晚期糖基化终末产物的产生条件。这为烟叶中AGEs的形成提供了潜在可能性。然而，卷 烟产品的最终消费形式是吸食烟气。因此，考察卷烟烟气中的AGEs十分必要，目前尚未见 报道卷烟烟气中AGEs的分析检测方法。
[0003] AGEs的检测方法主要包括酶联免疫法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相 色谱-串联质谱法（LC-MS/MS)。与其它分析方法相比，LC-MS/MS法灵敏度更高，且二级质 谱能更有效地排除假阳性，定性准确度更高，已被广泛用于加工食品中AGEs的检测。由于 针对食品样品基质的特殊性，一般首先需对样品进行脱脂、还原、蛋白质沉淀、蛋白质水解 等步骤 [3]，然后进行固相萃取技术[3]或者衍生化反应[4]以提高检测灵敏度，前处理十分繁 琐费时。本发明针对卷烟烟气基质建立了样品前处理方法，并直接采用LC-MS/MS技术进行 分析，无需衍生化反应，前处理简单高效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况、针对卷烟主流烟气中AGEs (包括羧甲 基赖氨酸（CML)和羧乙基赖氨酸（CEL))检测而提供的一种LC-MS/MS分析方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，是通过液相色谱-串联质谱法 检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物（AGEs)包括羧甲基赖氨酸（CML)和羧乙基赖氨 酸（CEL)的方法，其具体步骤包括： a、样品制备与处理：抽吸卷烟样品，并用剑桥滤片捕集卷烟烟气总粒相物。将抽吸过的 滤片加入锥形瓶中，加入一定体积的盐酸溶液及混合氘代内标溶液，进行超声萃取。取部分 萃取溶液上样到已活化过的固相萃取柱上，依次用一定体积的盐酸溶液和水淋洗，最后采 用一定体积的氨水-甲醇溶液对固相萃取柱进行洗脱。固相萃取过程中液体保持一定的流 速。洗脱液采用氮气吹干，然后加入ImL水复溶，取复溶后的溶液到色谱瓶中，进LC-MS/MS 仪器分析。
[0006] b、样品分析条件：LC_MS/MS分析所用色谱柱为C18液相色谱柱；柱温：30 °C ;流 动相A :含有0. 1%甲酸的水(体积比)，流动相B :含有0. 1%甲酸的乙腈(体积比）；流速300 yL/min;进样体积10 yL;梯度洗脱条件见表1。
[0007] 表1:梯度洗脱条件
【主权项】
1. 一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：是通过液相色 谱-串联质谱法检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物（AGEs )包括羧甲基赖氨酸（CML) 和羧乙基赖氨酸（CEL)的方法，具体步骤包括： 样品制备与处理：抽吸卷烟样品，并用剑桥滤片捕集卷烟烟气总粒相物，将抽吸过的 滤片加入锥形瓶中，加入一定体积的盐酸溶液及混合氘代内标溶液，进行超声萃取；取部分 萃取溶液上样到已活化过的固相萃取柱上，依次用一定体积的盐酸溶液和水淋洗，最后采 用一定体积的氨水-甲醇溶液对固相萃取柱进行洗脱，固相萃取过程中液体保持一定的流 速，洗脱液采用氮气吹干，然后加入ImL水复溶，取复溶后的溶液到色谱瓶中，进LC-MS/MS 仪器分析； 样品分析条件：LC-MS/MS分析所用色谱柱为C18液相色谱柱；柱温：30 °C ;流动相A : 含有0. 1%甲酸的水，流动相B :含有0. 1%甲酸的乙腈，流速300 μ L/min，进样体积10 μ L， 梯度洗脱；离子源：电喷雾电离源（ESI);扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测 MRM ;电喷雾电压：5000V ;气帘气压力：30 psi ;辅助气1压力：70 psi ;辅助气2压力：70 psi ;尚子源温度：550 C。
2. 根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在 于：步骤a中所述的抽吸卷烟为4~10支，卷烟抽吸采用直线吸烟机按照YC/T29-1996规定 的标准条件抽吸。
3. 根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在 于：步骤a中所述的萃取溶液为HCl溶液，浓度范围为0. 1M~0. 5M，用量范围为20 ~ 60 mL， 超声萃取时间范围为15 ~ 60 min。
4. 根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在 于：步骤a中混合氘代内标为(14-CML和d4-CEL，用量为10〇μL。
5. 根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征 在于：步骤a中固相萃取柱为阳离子交换固相萃取柱，型号为Dikma ProElut PXC，规格 150mg/6mL/30pkg，依次加入3mL甲醇，3mL0.1 M盐酸溶液进行活化。
6. 根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在 于：步骤a中固相萃取柱淋洗步骤为依次加入3mL0.1 M盐酸，3mL水；步骤a中固相萃取柱 洗脱液组成为5%氨水-甲醇溶液，洗脱体积为5~10mL ;步骤a中固相萃取过程中液体流速 为靠重力自然流下。
7. 根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在 于：步骤b中所述的C18液相色谱柱型号为Agilent Proshell 120 SB-C18，规格2.7 μ m， 3· 0 X 150mm〇
8. 根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在 于：步骤b中的梯度洗脱条件如下； 梯度洗脱条件
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【专利摘要】一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物（AGEs）的方法，具体包括对羧甲基赖氨酸（CML)和羧乙基赖氨酸（CEL)）的分析测定。该方法包括采用剑桥滤片捕集卷烟烟气总粒相物后，采用盐酸溶液超声萃取滤片，结合阳离子交换固相萃取柱净化方法和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）进行分析。本发明的特征在于：（1）首次建立卷烟主流烟气中AGEs的检测方法；（2）根据卷烟烟气样品基质的特征，建立了样品前处理方法，不需要衍生化反应，前处理简单高效；（3）该方法灵敏度高、定性准确度好，适用于大批量样品的分析。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104634897
【申请号】CN201510077987
【发明人】余晶晶, 颜权平, 王昇, 赵阁, 王冰, 蔡君兰, 丁丽, 于永杰, 谢复炜, 张晓兵
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月14日