链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种同时检测动物源性食品（如牛奶等） 中链霉素、四环素类残留量的链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条。
【背景技术】
[0002] 链霉素（Str印tomycin)为氨基糖式类抗生素,是继青霉素后第二个生产并用于临 床的抗生素，它有抗结核杆菌的特效作用。链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水， 不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳定。链霉素对各种革兰氏阴性细菌及革兰氏 阳性细菌均有良好的抗菌作用，适用于治疗细菌性痢疾或其他细菌性肠道感染，其机理为 与细菌核糖体30S亚单位的特殊受体蛋白结合，抑制蛋白合成。其主要毒性为耳毒性和肾 毒性，可引起眩晕，听力减退，耳鸣或耳部胀满感，肾功能损害等，也可致神经肌肉阻滞和神 经毒性反应。因此，其在动物性食品中的残留会严重影响人类健康。为了保障动物源性食品 的安全，我国规定链霉素药物在动物源性食品中的最大残留限量（MRL)牛奶为200 μ g/kg， 肌肉、脂肪、肝组织中为600 μ g/kg，肾组织中为1000 μ g/kg。
[0003] 四环素类药物（tetracyclines，TCs)为广谱抗生素，由放线菌产生，在化学结构 上属于氢化并四苯环衍生物。主要包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素和多西环素等。 另外，四环素、金霉素和土霉素还可在动物体内经代谢而转化为差向四环素、差向金霉素和 差向土霉素，差向四环素类药物的药效极低或消失，但它们的毒副作用增加，已经被欧盟确 定为四环素、金霉素和土霉素的残留标识物。四环素类抗生素含有许多羟基、烯醇羟基及羰 基，在酸性和碱性条件下均不稳定，，在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物。 四环素类药物抗菌作用强，抗菌谱广，对革兰氏阴性需氧菌和厌氧菌、立克次体、螺旋体、支 原体、衣原体及某些原虫等有抗菌作用，被广泛用于临床各种感染性疾病的治疗。但其在 动物性食品中的残留可导致诸多不良反应如胃肠道反应、肝损害、肾损害及二重感染等。临 床广泛应用也可导致对四环素类药物的耐药菌株迅速增加。因此对动物性食品中四环素类 药物的残留检测非常重要也很必要。我国规定奶、肉中四环素类抗生素的最大残留限量为 100 μ g/kg，蛋中最大残留限量为200 μ g/kg，肝中最大残留限量为300 μ g/kg，肾中最大残 留限量为600μ g/kg。
[0004] 现有的链霉素和四环素类药物检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样 品的净化、浓缩等步骤的影响较大，再者这些方法需要复杂的仪器，过程繁琐，不适应现场 大量样本的筛查。目前尚无同时检测链霉素和四环素类药物的残留量的产品。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条。
[0006] 本发明提供的用于检测链霉素和四环素类的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的 样品板和至少一个试纸条；
[0007] 所述样品槽的底部附着有链霉素特异性抗体的胶体金标记物和四环素特异性抗 体的胶体金标记物；
[0008] 所述试纸条包括底板1、反应膜2、样品吸收垫3和吸水垫4 ;所述样品吸收垫、所 述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始 端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；所述反应膜上由始端至末端依次具 有T 2线、T1线和C线，所述T2线、T1线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T 2线和T1 线上分别包被如下两种偶联物(两种偶联物可任意排序）：四环素-载体蛋白偶联物、链霉 素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与链霉素特异性抗体和/或四环素特异性抗体结 合的抗抗体。
[0009] 所述链霉素特异性抗体可为链霉素单克隆抗体或链霉素多克隆抗体。所述四环素 特异性抗体可为四环素单克隆抗体或四环素多克隆抗体。所述链霉素单克隆抗体具体可为 链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株STR-6A2CGMCC No. 8404分泌的单克隆抗体。所述四环素 单克隆抗体具体可为四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株TC-4C3CGMCC No. 8408分泌的单克隆 抗体。
[0010] 以上任一所述的载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白。
[0011] 所述链霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为BSA，链霉素与BSA的摩 尔结合比具体可为8:1。
[0012] 所述四环素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为BSA，四环素与BSA的摩 尔结合比具体可为12:1。
[0013] 所述链霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
[0014] (1)取2. 544g碳酸钠，溶于24ml水；
[0015] (2)取432mg硫酸链霉素，溶于12ml步骤（1)得到的碳酸钠溶液；
[0016] (3)取300mg BSA，溶于12ml步骤（1)得到的碳酸钠溶液；
[0017] (4)将步骤（2)得到的链霉素溶液加入步骤（3)得到的BSA溶液中并混匀，然后加 入2. 4mll0% (体积比）戊二醛水溶液并室温搅拌45min，然后加入6ml20mg/mlNaBH4水溶液 并4°C静置过夜，然后用PBS缓冲液（pH7. 2、0. 01M)进行透析，然后4500rpm离心6min并取 上清液(链霉素-载体蛋白偶联物溶液)。
[0018] 所述四环素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
[0019] (1)取50mg四环素，溶于2ml甲醇；
[0020] (2)取 60mg BSA，溶于 3ml 醋酸钠缓冲液（ρΗ4· 5、0· lmol/L);
[0021] (3)将步骤（1)得到的四环素溶液加入步骤（2)得到的BSA溶液中，然后加入 140 μ L10% (体积比）甲醒水溶液并室温搅拌8h,然后用纯水进行透析,然后4500rpm离心 6min并取上清液（四环素-载体蛋白偶联物溶液)。
[0022] 链霉素特异性抗体的胶体金标记物和四环素特异性抗体的胶体金标记物的制备 方法均如下：
[0023] (1)在沸腾的IOOmL的0· 01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%柠檬酸三钠 水溶液，获得终浓度为〇. 01%的胶体金溶液(胶体金的直径为15-20nm);
[0024] (2)用0· lmol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8. 5 ;
[0025] (3)将1 μ LlOmg/mL的特异性抗体溶液(链霉素特异性抗体溶液或四环素特异性 抗体溶液)加入ImL步骤（2)得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10 μ L20g/100ml 的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10 μ LlOg/lOOml的PEG_水溶液并搅拌15分钟，然 后4°C、4000g离心15min取上清液，然后4°C、12000g离心20分钟取沉淀；
[0026] (4)用PBS缓冲液（pH7. 2、2mM)溶解步骤（3)得到的沉淀，4°C、12000g离心20分 钟取沉淀，然后用200 μ L含lg/100ml BSA的PBS缓冲液（pH7. 2、2mM)重悬沉淀，得到特异 性抗体的胶体金标记物。
[0027] 所述链霉素特异性抗体的胶体金标记物和所述四环素特异性抗体的胶体金标记 物均可以冻干品的形式附着于于所述样品槽底部。这样做的优势是简化样品前处理过程， 提高产品的检测的灵敏度。所述样品板的制备方法具体如下：取微孔反应板(如8联ELISA 微孔反应板)，向每个样品槽中加入链霉素特异性抗体的胶体金标记物和四环素特异性抗 体的胶体金标记物各25 μ 1，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到样 品槽底部附着有两种特异性抗体的胶体金标记物的样品板。
[0028] 所述试纸条还可包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜 5。所述固定膜可以促进试纸条中各组件的稳固性，优选为防水材质。所述固定膜还具有避 免样品或试剂与外界环境中的物质发生反应的作