一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 盐酸克伦特罗（CL)俗名"瘦肉精"，可显著提高胴体的瘦肉率，因而被滥用于饲养 业，并通过食物链在人体内富集，对人体造成多种毒副作用，甚至死亡。基于抗原抗体特异 识别的免疫检测技术因其具有高度特异性、敏感性和稳定性等优点，已成为较常用的CL残 留的检测方法。但这种方法存在检测时间长、需要专业人员操作等缺点，不能用于现场和快 速检测。
[0003] 免疫传感器是一种将固定化抗体与换能器密切配合，对特定目标分析物具有选择 性和响应的分析装置。该装置既具有免疫检测技术的优点，又具有传感器操作简单、方便、 快捷的特点，已成为CL快速检测领域的研究开发热点。
[0004] 在免疫传感器制备过程中，固定化抗体的稳定性和活性是保证该法测定CL灵敏 度与特异性的关键因素。目前对抗盐酸克伦特罗单克隆抗体（以下简称CL mAb)的固定方 式主要为物理吸附或化学交联法，采用物理吸附方式制备的固定化抗体在使用过程中存在 不稳定、容易脱落和渗漏等技术问题，而通过化学交联方式制备的固定化抗体虽稳定，但存 在活性损失严重等技术问题。为了保证固定化抗体的生物活性，固定前一般需采用色谱联 用技术对含抗体的小鼠腹水进行分离纯化，整个分离过程繁琐耗时，难以实现快速、高通量 分离目。这些都严重限制了以固定化抗体为敏感元件的免疫传感器在CL检测中的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决固定化抗体在免疫传感器的应用中存在不稳定、容易脱 落、渗漏或活性较低的技术问题，而提供一种固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方 法。
[0006] 本发明的技术原理 双水相萃取技术是依据物质在两相间的选择性分配对进入体系的物质进行分离。具有 分离时间短(一般只需30-60min)、选择性好、易于实现放大和进行连续性操作等优点。但经 双水相系统提纯富集后，对分散于PEG相中抗体的进一步分离及PEG的回收是目前存在的 技术难点。采用原位固定的方式将分散于PEG相中的抗体直接固定于载体上，可同时实现 抗体的固定和PEG相的回收再利用，同时由PEG形成的网络结构可防止固定化抗体的渗漏， 增加了固定化抗体的稳定性和活性。
[0007] 本发明的技术方案 一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体（CL mAb)的制备方法，具体包括如下步骤： (1)、含CL mAb腹水的制备，即通过细胞融合技术及间接酶联免疫法筛选出稳定分泌 抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株；然后进行扩增培养，每隔24h传代一次，使其 处于对数生长期；然后将处于对数生长期的稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤 细胞注射于用石蜡初步免疫过的小鼠腹部，两周后采集腹水，即得到含有抗盐酸克伦特罗 单克隆抗体的腹水，步骤如下； ① 、将25mg盐酸克伦特罗（以下简称CL)溶解于IOmL的浓度为lmol/L的盐酸水溶液 中，向其中缓慢滴加〇. 27mol/L的亚硝酸钠溶液，直至淀粉KI试纸颜色变为深紫色后停止 滴加，并继续反应45min，再加入0.1 mL质量百分比浓度为5%的氨基磺酸铵水溶液终止反 应，即得重氮化的CL ; 将上述所得的重氮化的CL加入到5mL浓度为lOOmg/mL的牛血清白蛋白（以下简称 BSA)水溶液中，4°C下缓慢搅拌反应24h，反应过程中以lmol/L的NaOH溶液维持pH为 9. 0-9. 5,反应完毕后，对反应液进行透析，得到CL-BSA偶联物； ② 、对6-8周龄、体重18-22g的雌性纯系Balb/C小鼠进行腹腔注射免疫； 初次免疫采用充分乳化的等体积的CL-BSA偶联物与福氏完全佐剂，剂量为50 μ g/ 只； 2周后加强免疫，每隔两周一次，加强免疫以福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂，剂量 为 100 μ g/ 只； 从第三次加强免疫开始，每次加强免疫后第三天进行眼眶采血，通过间接酶联免疫法 (以下简称IELISA)测定其血清中抗体活性，直至血清0D450nm大于I. 0时停止免疫； ③ 、停止加强免疫后，取出小鼠脾脏破碎成单个的细胞悬液，并与SP2/0骨髓瘤细胞按 照3-10 :1的比例混匀，得到混悬液； 向所得的混悬液中加入1ml质量百分比浓度为50%的PEG4000水溶液，缓慢摇匀融合 Imin后，得到融合细胞，将所得的融合细胞放入96孔细胞培养板中，加入100 μ L/孔的HAT 培养基，并控制温度为37°C，0)2和空气按体积比计算，CO2:空气为5:100的环境下培养两 周，得到融合细胞； 向上述所得的融合细胞中加入100 μ L/孔的HT培养基进行培养24h，所得的细胞培养 液离心，所得的上清液进行IELISA检测，最终筛选到能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗 体的高特异性的杂交瘤细胞株，其效价大于3 X IO6; ?、取6-8周的Balb/C小鼠，按照ImL/只的量，向Balb/C小鼠腹腔注射液体石錯，七 天后腹腔接种上述处于对数生长期的能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细 胞，每只注射IX IO6个对数生长期的能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细 胞，两周后采集腹水，即得到含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水，记为含有CL mAb的腹 水； (2 )、含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水的纯化 ① 、配制PEG6000/磷酸盐双水相体系，所述的PEG6000/磷酸盐双水相体系，按重量 百分比计算，含15%的分子量为6000的PEG，15%的磷酸氢二钾（K 2HPO4) /磷酸二氢钠 (NaH2PO4)溶液（ρΗ8· 0)、15%的NaCl和余量的去离子水构成； ② 、将步骤（1)所得的含有CL mAb的腹水置于PEG6000/磷酸盐双水相体系中，混合均 匀后，于4°C静置60min; ③ 、将②中静置60min后的体系4000r/min离心10min，收集上相即得到纯化后的含有 CL mAb 的 PEG 相； (3) 、聚苯乙烯小球的预处理 ① 、将直径为3mm的聚苯乙烯小球浸入质量百分比浓度为0. 01%的新洁尔灭水溶液中， 4 °C搅拌过夜； ② 、依次采用去离子水和0. 〇lmol/L、pH7. 2的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液清洗聚 苯乙烯小球，然后在控制温度为35°C的烘箱中烘干，即得预处理后的聚苯乙烯小球； (4) 、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的原位固定 ① 、按聚苯乙烯小球：纯化后的含有CL mAb的PEG相为1粒聚苯乙烯小球：0. 65 mL纯 化后的含有CL mAb的PEG相的比例，将步骤（3)中预处理后的聚苯乙烯小球完全浸没于步 骤（2)中所得的纯化后的含有CL mAb的PEG相中，4°C条件下缓慢搅拌吸附90min，即得固 定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的微球，记为固定化CL mAb的微球； ② 、用双蒸水对①中获得的固定化CL mAb的微球进行清洗，直到清洗液中检不出CL mAb活力为止； ③ 、将②中清洗后的固定化CL mAb的微球控制在4°C的条件进行脱水，脱水完成后，即 完成了 CL mAb的固定化，得到固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，即为固定化的CL mAb。
[0008] 上述所得的固定化的CL mAb置于0. 02M、pH9. 6的碳酸钠和碳酸氢钠缓冲液中，控 制温度为4°C贮存备用。
[0009] 将上述所得的固定化的CL mAb充满到干净的两端带筛网的柱式壳体中，即得固定 化CL mAb的小柱，在4°C贮藏30天后，固定化CL mAb的小柱仍保留初始活性的95%，用恒 流泵以lml/min的流速连续冲刷30ml的0.0 lmol/L、pH7. 2的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓 冲液后，固定化CL mAb的小柱仍保留初始活性的98%。
[0010] 本发明的有益效果 本发明的一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，由于采用操作条件温 和的PEG6000/磷酸盐双水相体系纯化和原位固定结合的方法，因此不仅能够更高效的对 小鼠腹水中的CL mAb进行分离纯化，CL mAb的回收率达85%以上。还能获得活力较高的 固定化的CL mAb，其0D450nm为1. 8。同时也实现了 PEG相的再利用。
[0011] 本发明提供的一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，由于形成 PEG6000/磷酸盐双水相体系的相组分价格较低，且PEG6000/磷酸盐双水相体系纯化和原 位固定方法操作简便，因此其制备成本低廉，可适用于规模化生产。
[0012] 进一步，本发明提供的一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，由 于直接在含有CL mAb的PEG相中进行原位固定，因此PEG形成的网络结构增加了固定化的 CL mAb的稳定性。固定化的CL mAb柱在4°C|C藏30天后，固定化的CL mAb仍保留初始活 性的95%。用恒流泵以lmL/min的流速连续冲刷30mL后，固定化的CL mAb仍保留初始活性 的 98%。
【具体实施方式】
[0013] 下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
[0014] 本发明所用的HAT培养基、HT培养基、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG (免疫 球蛋白）、福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自于生工生物工程(上海）股份有限公司； 本发明中的效价定义，即在96孔板内使CL-BSA偶联物与倍比稀释的CL mAb发生特异 性结合，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，根据显色反应来鉴定抗体与抗原的结 合情况，并且以吸光度值大于阴性对照2. 1倍时的稀释倍数作为CL mAb的效价。
[0015] 实施例1 一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体在双水相体系中的原位固定方法，具体包括如下步 骤： (1)、含CL mAb腹水的制备 ① 、将25mg CL溶解于lmol/L的盐酸溶液中，向其中缓慢滴加0· 27mol/L的亚硝酸钠 溶液，直至淀粉KI试纸颜色变为深紫色后停止滴加，并继续反应45min，再加入5%氨基磺酸 铵终止反应，得到重氮化的CL ; 将该重氮物滴入lOOmg/mL的BSA溶液中，4°C下缓慢搅拌反应24h，反应过程中以 lmol/L的NaOH溶液维持pH为9. 0-9. 5,反应完毕后，对反应液进行透析即获得CL-BSA偶 联物； ② 、对6-8周龄、体重18-22g的雌性纯系Balb/C小鼠进行腹腔注射免疫，初次免疫采 用充分乳化的等体积的CL-BSA偶联物与福氏完全佐剂，剂量为50 μ g/只； 2周后加强免疫，加强免疫时以福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂，剂量为100 μ g/ 只； 从第三次免疫开始，每次免疫后第三天进行眼眶采血，通过IELISA法测定其血清中抗 体活性，直至血清〇D450nm大于I. 0时停止免疫； ③ 、停止免疫后，取出小鼠脾脏破碎成单个的细胞悬液，并与SP2/0骨髓瘤细胞按照 3-10 :1的比例混匀，向其中加入质量分数为50%的PEG4000溶液进行缓慢摇匀融合。融 合Imin后，将融合细胞放入96孔细胞培养板中，加入HAT培养基，并置于5%C0 2、37°C培养 箱培养两周；两周后再用HT培养基进行培养，并对细胞培养液的上清进行IELISA检测，最 终筛选到能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的高特异性的杂交瘤细胞株，其效价大于 3 X 106；