一种快速测定畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及畜禽粪便中氣唾诺丽类药物的测定，具体的说是一种新的畜禽粪便中 氣唾诺丽类药物的提取方法。
【背景技术】
[0002] 氣唾诺丽是一类全人工合成抗菌类药物，在化学上与蔡巧丽酸相关，其作用机 理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶，使酶不能在DNA双链上引入切口，破 坏细菌的代谢和繁殖，迅速杀灭细菌。最初该类药物用于治疗尿道感染，现在已发展到 治疗系统感染疾病，并且在养殖业中作为预防和治疗药物普遍使用。氣唾诺丽类药物 在动物体内吸收性差，75% W上会W原形药物形式排出体外(参考文献1 ;管荷兰，于海 凤，王嘉宇.氣唾诺丽类抗生素在±壤中的归趋及其生态毒性研究进展.生态学杂志， 2012, 31 (12) :3228-3234)。近年来，氣唾诺丽类药物药物在养殖畜禽粪中被普遍发现， 含量达到mg ? kg-i级别（参考文献2 ;马丽丽，郭昌胜，胡伟，沙健，朱兴胚，阮悦斐，王玉 秋.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定±壤中氣唾诺丽、四环素和賴胺类 抗生素.分析化学研究报告，2010,38(1) :21-26.;参考文献3;KarciA, Balciogki lA.Investigation of the tetracycline,sulfonamide,and fluoroquinolone antimicrobial compounds in animal manure and agricultural soils in Turkey. Science of the Total Elnvironment, 2009,407:4652 - 4664)。那么大量氣唾诺丽类药物 将随畜禽粪便进入环境，将会对地表水、农田±壤，甚至地下水造成污染。因此，对粪便中残 留的氣唾诺丽类药物的测定尤为重要。
[0003] 现阶段国内外提取畜禽粪便中氣唾诺丽类药物的方法多借鉴测定农药残留的方 法。使用W上方法有如下缺点；1)其它方法多采取有机试剂提取，对人体有害；2)部分方法 提取后续步骤需要使用固相萃取柱分离，其价格较贵，也会造成操作复杂；3)部分方法多采 用液相串联质谱，虽然具有更低的灵敏度，对样品的分离度要求不高，但是存在较强的基质 效应，尤其是对复杂的粪便样品，并且仪器的使用及维护成本很高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种重复性好，灵敏度高，并且简单易行的测定畜禽粪便中 氣唾诺丽类药物的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] 1)采集的禽畜粪便样品首先需要冻干处理，冻干后的样品避光保存，分析前用研 鉢研磨，并过2mm筛后进行样品前处理；
[0007] 2)准确称取0. 50-1.OOg样品置于10-20血塑料离也管中，加入50%氯化巧盐酸缓 冲液5-10血，润旋混合1分钟，超声提取15-30分钟，离也（450化/min) 10分钟，收集上清 液；
[0008] 3)残渣用上述方法反复提取2次，合并上清液；
[0009] 4)溶液过0. 22 y m滤膜收集于踪色样品瓶中待测；
[0010] 5)首先用高效液相色谱仪器对单一标准样品进行定性分析(浓度为lO-lOOng/ 血)，确定其保留时间。色谱条件；色谱柱为Kromasil C18 (5um，250X4. 6mm)，于激发 波长280皿、发射波长450皿处进行检测，流动相为甲醇-水（78. 5:21. 5, V/V)，流速为 1. OmL . min-i，进样量为 20y L。
[0011] 6)标准曲线制备；制备混合标准品工作液系列浓度为10, 50,100,500, lOOOng/mL (每种标准品的浓度)，在同上色谱条件下进行测定。W为峰面积为纵坐标，氣唾诺丽浓度 (ng/mL)为横坐标建立各化合物标准曲线。
[0012] 7)在同上色谱条件下，对待测样品中的目标物含量进行测定，根据保留时间确定 目标物种类，根据标准曲线确定其含量。
[0013] 重要试剂的配置：
[0014] 50%氯化巧盐酸缓冲液；50g氯化巧溶于lOOmL去离子水，用Imol浓度的盐酸调节 抑为3.0,即制备成提取液。
[0015] 流动相：甲醇与水按照78. 5:21. 5体积比配置所需流动相。
[0016] 本方法涉及的原理：
[0017] 低抑下，氣唾诺丽类药物主要W阳离子形态存在，其在粪便中吸附W阳离子吸附 为主；而金属离子会同阳离子态的氣唾诺丽类药物竞争吸附位，从而抑制氣唾诺丽吸附或 将已吸附的氣唾诺丽解吸下来；且价态越高竞争吸附能力越强；M+(Na\ K+)<M"(Ca"、Mg"、 Zn2+)<]\r(Al3+)。
[0018] 本发明创新点如下：
[0019] 1、采用非有机试剂提取：其它方法多采用有机试剂提取，对人体危害较大；另外， 本方法中的提取液所需药品容易购买且价格便宜。
[0020] 2、不使用固相萃取柱；其它方法多采用固相萃取柱分离提取样品，造成提取过程 耗时费力，且此消耗品价格较贵。
[0021] 3、采用高效液相色谱测定：本方法采用配有英光检测器的高效液相色谱测定提 取样品中的氣唾诺丽，该仪器具有速度快、分辨率高和灵敏度高等优点，且运行和维护成本 低，完全能达到测定需要。
[002引注意事项：
[0023] 1)试验中所用器皿需彻底洗净，并用离子水冲洗，W确保无氣唾诺丽类药物存在。
[0024] 2)若所测定样品中含有植物残体，塑料等杂物，应在冷冻干燥前剔除，W免影响检 查结果。
[0025] 3)氣唾诺丽类药物容易光解，所W整个提取过程最好不要在强光下进行，特别是 过滤后的溶液应该保存在踪色试剂瓶中，若短时间内不测定，最好保存在4C条件下。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1 ;测定本方法的回收率、检测限与定量限
[0027] 具体过程如下：
[0028] 1)在迂宁省选取规模化养猪场采集猪粪样品，进行多点采样并混合，样品采集后 用黑色塑料袋密封，并立即存放于冰盒中冷藏存放，然后保持冷冻状态下尽快运回实验室， 并进行冷冻干燥处理；
[0029] 2)冻干后的样品避光保存，分析前用研鉢研磨，并过2mm筛后收集过筛后的样品；
[0030] 3)取四组猪粪样品（每组H份平行的重复样品）中均加入四种常见的氣唾诺丽类 药物（诺氣沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星）混标溶液，混标溶液中四种化合物的加标 浓度分别设置为0.〇lmg/kg、0.1 mg/kg、1. Omg/kg和10.0 mg/kg，混合均匀后放置2化使药物 与样品介质充分接触，W模拟实际情况；
[0031] 4)准确称取每组0. 50g样品分别置于lOmL塑料离也管中，加入50%氯化巧盐酸缓 冲液5mU润旋混合60S，超声提取15分钟，离也（450化/min) 10分钟，收集上清液；
[0032] 5)残渣用上述方法反复提取2次，合并上清液，溶液过0. 22 y m滤膜收集透过滤膜 的液体于踪色样品瓶中待测；
[003引 6)用高效液相色谱仪器对lOOng/mL的单一标准样品诚氣沙星、环丙沙星、洛美 沙星和恩诺沙星）进行定性分析，确定其保留时间。色谱条件：色谱柱为Kromasil C18 (5um，250X4. 6mm)，流动相为甲醇-水（78. 5:21. 5, V/V)，流速为1. 0血? min-1，进样量为 20 y L，于激发波长280nm、发射波长450nm处进行检测。
[0034] 7)标准曲线；制备四种氣唾诺丽的混合标准品工作液，混合标准品工作液中诺氣 沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星的系列浓度分别为10、50、100、500、1000ng/mL，W峰 面积为纵坐标，氣唾诺丽浓度（ng/mL)为横坐标建立各化合物标准曲线；根据保留时间定 性，根据标准曲线确定其含量；根据lOng/mL混合标准品工作液色谱峰，按3倍信噪比计算 方法检测限，按10倍信噪比计算样品定量限。
[0035] 本方法测定猪粪中氣唾诺丽类药物的平均回收率的结果如表1所示。从表中可W 看出，该方法回收率很好，测定样品的回收率均在85% W上，定量限在yg/kg级别，因此该 方法完全能满足测定畜禽粪便中氣唾诺丽类药物的需要。
[0036] 表1本方法回收率结果
[0037]
【主权项】
1. 一种快速测定畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的方法，其特征在于： 1) 将冻干的禽畜粪便样品研磨，并过2mm筛后，筛下组份待用； 2) 准确称取0. 50-1. OOg样品置于离心管中，加入50%氯化钙盐酸缓冲液5-10mL，涡旋 混合1分钟，超声提取15-30分钟，4500r/min离心10分钟，收集上清液； 3) 残渣用上述步骤2)的方法反复提取2-5次，合并上清液； 4) 溶液过0. 22 y m滤膜收集透过滤膜样品待测； 5) 首先用高效液相色谱仪器对氟喹诺酮类药物中的一种或二种以上的标准样品分别 进行定性分析，确定其保留时间； 6) 标准曲线制备：制备系列浓度的氟喹诺酮类药物中的一种或二种以上的混合标准品 工作液，标准品工作液中每种标准品的系列浓度分别为10、50、100、500、1000ng/mL，在同上 步骤5)相同的色谱条件下进行高效液相色谱测定； 以峰面积为纵坐标，每种氟喹诺酮药物的对应的浓度（ng/mL)为横坐标建立各氟喹诺 酮药物化合物标准曲线； 7) 在同上步骤5)色谱条件下，对待测样品中的目标物含量进行高效液相色谱测定，根 据保留时间确定目标物种类，根据标准曲线确定其含量。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于： 步骤1)采集的禽畜粪便样品首先需要冻干处理，冻干后的样品避光保存，分析前用研 钵研磨，并过2mm筛后进行样品前处理。
3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述氟喹诺酮类药物为诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星中的一种或二种以 上。
4. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：色谱条件：色谱柱为Kromasil C18 (5um，250X4. 6mm)，于激发波长280nm、发射波长450nm处进行检测，流动相为甲醇-水 (78. 5:21. 5, V/V)，流速为 1.0 mL ? mirT1，进样量为 20ii L。
5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：50%氯化钙盐酸缓冲液：50g氯化钙溶于 IOOmL去离子水，用Imol浓度的盐酸调节pH为3. 0,即制备成提取液。
【专利摘要】本发明涉及一种新的畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的提取方法，1）将冻干的禽畜粪便样品研磨过筛；2）称取0.50-1.00g样品置于离心管中，加入50%氯化钙盐酸缓冲液5-10mL，涡旋混合1分钟，超声提取15-30分钟，4500r/min离心10分钟，收集上清液；3）首先用高效液相色谱仪器对氟喹诺酮类药物中的一种或二种以上的标准样品分别进行定性分析，确定其保留时间；4）以峰面积为纵坐标，每种氟喹诺酮药物的对应的浓度（ng/mL）为横坐标建立各氟喹诺酮药物化合物标准曲线；5）对待测样品中的目标物含量进行高效液相色谱测定，根据保留时间确定目标物种类，根据标准曲线确定其含量。本发明重复性好，灵敏度高。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104749262
【申请号】CN201310737449
【发明人】徐永刚, 宇万太, 马强, 周桦
【申请人】中国科学院沈阳应用生态研究所
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月27日