六味地黄制剂的超高效液相双波长多指标含量测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及中药测试技术领域，更具体设及一种六味地黄制剂的超高效液相双波 长多指标含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 六味地黄作为"滋补肾阴"的代表方剂，其疗效不容置疑，现今市场上的六味地黄 制剂众多，故只有确保其质量，才能让该一经典古方充分发挥其治疗优势。2010版中国药 典规定的含量测定；对于水蜜丸、小蜜丸、大蜜丸该S种剂型，含牡丹皮W丹皮酪计，水蜜丸 每Ig不得少于0. 90mg;小蜜丸每Ig不得少于0. 70mg;大蜜丸每丸不得少于6. 3mg。含酒 奥肉W马钱巧计，水蜜丸每Ig不得少于0. 7〇mg;小蜜丸每Ig不得少于0. 50mg;大蜜丸每丸 不得少于4. 5mg。对于浓缩丸，每Ig含酒奥肉W马钱巧计，不得少于1. 4mg，每Ig含牡丹皮 W丹皮酪计，不得少于1. 8mg。胶囊剂每粒含牡丹皮W丹皮酪计，规格（1)不得少于3.Omg; 规格（2)不得少于1. 5mg，酒奥肉W熊果酸计，规格（1)不得少于0. 60mg;规格（2)不得少 于0.30mg。其中丹皮酪和马钱巧采用高效液相色谱检测，且色谱条件不同，检测波长分别为 274nm和236nm，熊果酸采用薄层色谱法进行含量测定，操作步骤繁琐，耗时较长，不利于快 速高效的检测且不能从整体评价和控制六味地黄整方的质量。
[0003] W往有关六味地黄制剂的质量控制研究报道较多的是关于高效液相色谱联接紫 外检测器，但往往能同时检测的成分较少，也不能从整体上进行质量控制，有报道液质联 用和胶束电动毛细管色谱对六味地黄丸进行多成分含量测定，均能同时检测其中的四种成 分，但此类方法的普及受仪器较为少见的限制。还有文献报道高效液相色谱联用二极管阵 列和蒸发光散射检测器能同时检测六味地黄丸中的八种成分，但采用两种检测器检测过程 较为繁琐，且耗时费力。超高效液相色谱扣册LC)采用小颗粒填料色谱柱和超高压系统，可 W显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，又可W显著缩短分析周期，减小试剂消耗，配备 二极管阵列检测器值AD)后，检测范围更为拓宽。因此采用超高效液相色谱，经过DAD全波 长扫描确定适合的检测波长，能对六味地黄丸及胶囊中的主要成分进行快速、全面的检测， 仪器易得，方法简便操作性强，有望成为该复方制剂质量控制的强大手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，针对现有技术中存在的缺陷，提供一种六味地黄制剂多成分 的超高效液相双波长含量测定方法。本发明提供的方法可W实现对六味地黄制剂中的主要 成分进行快速、全面的检测，仪器易得，方法简便，操作性强。
[0005] 本发明提供了一种六味地黄制剂的超高效液相双波长多指标含量测定方法，该方 法具体包括W下步骤：
[000引 （1)取六味地黄制剂，粉碎后精密称取，W浓度lg/10~30ml溶解于甲醇中，超声 提取，离屯、，取上清液过滤，即得六味地黄制剂溶液，备用；
[0007] 似精密称取标准品，W浓度20~30yg/ml溶解于甲醇中，即得标准品溶液，备 用；
[0008] (3)采用超高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得六味地黄制剂溶液和 标准品溶液的色谱图；所述检测条件包括：
[0009] 色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
[0010] 采用梯度洗脱；其中，流动相A为浓度0. 08ml/100ml的磯酸水溶液，流动相B为己 膳；洗脱程序为；0~5111111，2~25%流动相6;5~8111111，25~70%流动相6巧~8.1111111， 70-95%流动相6;8.1~13111111，95%流动相6;
[0011]检测波长为 200-220nm和 238-250nm;
[0012] (4)根据标准品的浓度、标准品在色谱图中的峰面积W及六味地黄制剂中与标准 品相对应成分在色谱图中的峰面积，计算六味地黄制剂中与标准品相对应成分的含量。
[0013] 本发明所述六味地黄制剂为六味地黄水蜜丸、大蜜丸、浓缩丸或胶囊。
[0014] 本发明步骤（1)对六味地黄制剂的提取W及溶液的配制方法进行优化，从而增加 了检测的准确度。具体而言，所述超声提取的超声波频率优选为35000~45000Hz，提取时 间优选为20~40min在上述提取条件下，离屯、的速度优选为5000~20000转/分，离屯、时 间为5~15min。离屯、后，可使用孔径0. 2~0. 3ym的滤膜过滤对上清液进行过滤。通过 对上述条件的优选，可W提高后续步骤中检测的准确度。
[0015] 作为一种优选方案，本发明步骤（1)具体为：取六味地黄制剂，粉碎后精密称取， W浓度Ig/lOml溶解于甲醇中，用频率40000化的超声波提取30min，W10000转/分的速 度离屯、lOmin，取上清液，用孔径0. 22ym的滤膜过滤，即得六味地黄制剂溶液。
[0016] 本发明步骤（2)所述标准品根据六味地黄制剂中的有效成分和药典规定的检测 成分进行选取，包括没食子酸、原儿茶酸、1，2, 3, 4, 6-五没食子酷葡萄糖、丹皮酪、5-哲甲 基慷醒、莫诺巧、马钱巧、猜牙菜巧、巧药巧、苯甲酸和苯甲酯巧药巧。在本发明中，所述标准 品的浓度是指每种标准品分别的浓度，在实际操作时，可将各种标准品分别精密称量后，合 并，溶解于特定量的甲醇中，并混合均匀，得到混合标准品溶液。所述标准品的浓度优选为： 没食子酸、原儿茶酸、1，2, 3, 4, 6-五没食子酷葡萄糖、丹皮酪、5-哲甲基慷醒、莫诺巧、马钱 巧、猜牙菜巧、巧药巧、苯甲酸和苯甲酯巧药巧的浓度均为25yg/ml。
[0017] 由于不同成分在不同波长下出峰情况不同，因此，本发明优选在在检测波长为 200-220皿的条件下检测没食子酸、原儿茶酸、1，2, 3, 4, 6-五没食子酷葡萄糖、丹皮酪；在 检测波长为238-250皿的条件下，检测5-哲甲基慷醒、莫诺巧、马钱巧、猜牙菜巧、巧药巧、 苯甲酸、苯甲酯巧药巧。
[0018] 本发明步骤（3)所述检测的波长优选为2lOnm和238nm。采用该两个波长对上述 成分进行检测，可W实现最佳的分析效果。
[0019] 本发明步骤（3)所述磯酸水溶液浓度0. 08ml/100ml的含义为：每100ml溶液中含 有0. 08ml磯酸。所述梯度洗脱程序中，流动相B的百分比是指流动相B占两相体积之和的 体积百分比。
[0020] 本发明步骤（3)还可W包括W下检测条件；色谱柱的规格为100~250mmX2. 1~ 4. 6mm，优选为lOOmmX2. 1mm。色谱柱填充剂的粒径为1. 8~5. 0ym，优选为1. 8~2. 0ym， 进一步优选为1.8ym。所述填充剂可选用购自安捷伦科技公司的AgilentSBCi8。色谱 柱的柱温为30~40°C，优选为35°C。流动相流速为0. 1~1.Oml/min，优选为0. 4ml/min。 进样量为1~5y1，优选为1~2y1，进一步优选为1y1。
[0021] 由于标准品溶液和六味地黄制剂溶液的检测条件相同，在色谱图中，六味地黄制 剂中与标准品相对应成分出峰的保留时间和峰形应与标准品基本相同，因此，可W通过相 同的保留时间判断两幅色谱图中相对应的成分，并通过峰的形状辅助确认。本发明步骤（4) 通过比较标准品溶液色谱图和六味地黄制剂溶液色谱图中相对应成分的峰面积，根据标准 品的已知浓度，计算出六味地黄制剂溶液中与标准品相对应成分的浓度，进一步计算出六 味地黄制剂中与标准品相对应成分的含量。
[0022] 本发明方法采用超高效液相双波长多指标进行色谱检测，仅需不到10分钟即可 检测六味地黄丸及胶囊中至少11种主要成分，并对其进行定量。与传统的高效液相色谱法 相比，可将分析时间节省3/4W上，同时，节省了试剂耗费。本发明提供的方法采用双波长 检测，从而涵盖了六味地黄制剂中大部分含量较高的成分，且检测方法准确、可靠。
[0023] 本发明提供的超高效液相双波长多指标含量测定方法，可准确、简便、快速检测六 味地黄制剂，并有利于从整体上评价六味地黄制剂的质量，确保其临床疗效。
【附图说明】
[0024] 图1是210皿波长下的混合标准品与六味地黄浓缩丸样品（34号样品）色 谱图；图中标记；a、混合标准品，b、六味地黄