糖原磷酸化酶同工酶bb近红外荧光法检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外法荧 光检测试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)是一种心肌细胞中含量较高的酶。糖原磷酸化酶 为糖原分解的关键酶，在心肌细胞肌浆网构成糖原分解复合物，该复合物对缺血引起的糖 原分解特别敏感，使其构成发生改变，形成町溶性糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)，透过细胞 膜进入血液。
[0003] 糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)对心肌缺血缺氧敏感，在心肌损伤早期（小于4h) 即可释放入血，是急性心肌损伤早期诊断的一项很好的指标。对急性心肌缺血的早期诊断 优于心电图，是目前发现的急性心肌梗死（AMI)病人胸痛发作后4h内最敏感的指标。GPBB 的这一特点在AMI的早期诊断方面弥补了cTnl的不足。随着生物化学、免疫、分子生物学 及其检测技术的发展，发现GPBB对缺血性心肌损伤的早期诊断、产科、儿科学等方面的研 宄颇具价值。
[0004] 常用的酶联免疫吸附试验（ELIsA)等检测方法耗时、需要特殊设备，不适于急诊 室和现场对AMI的快速诊查的需要。
【发明内容】
[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种糖原磷酸化酶同工酶 BB近红外荧光法检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的糖原磷酸化酶同工酶BB近红 外荧光检测技术，解决现有技术中的问题。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检 测技术，可快速，准确的检测出人全血/血清/血浆中糖原磷酸化酶同工酶BB。
[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面提供一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒， 包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻 璃纤维素膜、包被有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。
[0008] 优选的，所述免疫荧光探针为抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体包被的近红 外荧光乳胶微球颗粒。
[0009] 优选的，硝酸纤维素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体和所述近 红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体可以为相同的抗糖 原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体，也可以为不同的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体。
[0010] 更优选的，所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为 Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外焚光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶 同工酶BB单克隆抗体为Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，或所述硝酸纤维素膜上包被的抗 糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam?.Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外荧光 乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam?Anti-GPBB抗体 [lG6]〇
[0011] 更优选的，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
[0012]近红外光（NIR)，是介于可见光（VIS)和中红外光（MIR)之间的电磁波，ASTM定义 NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很 小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大 为减少。
[0013] 本发明的第二方面提供所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒的 制备方法，包括如下步骤：
[0014] 1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分 散液中加入抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入 封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；
[0015] 2)将含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜 上，烘干备用；
[0016] 3)将步骤1)制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
[0017] 4)将步骤2)所得的硝酸纤维素膜、步骤3)所得的标记有免疫荧光探针的玻璃 纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光检测试剂 盒。
[0018] 优选的，所述步骤1)中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚， 制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种 或多种的组合。
[0019] 更优选的，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.l-20mg/ml，更优选为 4_8mg/ml〇
[0020] 优选的，所述步骤1)中，缓冲液为磷酸盐（PBS)缓冲液。
[0021] 更优选的，所述PBS缓冲液为0? 009-0. 011mol/L，PH7. 25-7. 35的PBS缓冲液。
[0022] 优选的，所述步骤1)中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。
[0023] 优选的，所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体、EDCA的 重量比为 9-11 :0? 9-1. 1 :0? 9-1. 1。
[0024] 在本发明一优选实施例中，乳胶颗粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体、 EDCA的投料量分别为lmg、100ug、100ug。
[0025] 优选的，所述封闭液为乙醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调 整乙醇胺的用量。
[0026] 优选的，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
[0027] 本领域技术人员可选取适当浓度和pH的PBS缓冲液，更优选为0. 009-0.Ollmol/ L，PH7. 25-7. 35 的PBS缓冲液。
[0028]优选的，所述步骤2)中，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中 还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合。
[0029] 更优选的，所述含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的 浓度为〇?l-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。
[0030] 优选的，所述步骤2)中，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中 抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的浓度为1. 8-2. 2mg/ml。
[0031] 优选的，所述步骤2)中，抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液的喷加 量为 0? 9-1.lul/cm。
[0032] 优选的，所述步骤2)中，烘干的具体条件为36_38°C烘箱烘干。
[0033] 所述喷加过程利用微量蛋白点膜系统。
[0034] 优选的，所述步骤1)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，所述步骤2)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，或所述步骤1)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为 AAbeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，所述步骤2)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗 体为Abeam?Anti-GPBB抗体[1G6]。
[0035] 优选的，所述步骤3)中，干燥的具体条件为真空干燥机干燥。
[0036] 本发明的第三方面提供了所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒 在糖原磷酸化酶同工酶BB检测领域的用途。
[0037] 所述用途具体为使用所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒对样 品中的糖原磷酸化酶同工酶BB进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多 种的组合。
[0038] 本发明所提供的检测试剂盒以人全血/血清/血浆为检测样本，结合近红外荧光 检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中的糖原磷酸化酶同工酶BB。所述试剂盒采用免 疫荧光层析法，其最小可测量可达〇. 6pg/ml，检测方便、成本低，灵敏度高，特异性好，比同 类定量诊断试剂价格低20-30%，大大节约了社会医疗成本，检测过程中样品收集及处理简 单，可快速准确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用，并可应用到临床检测中， 为临床治疗提供定性依据。
【具体实施方式】
[0039] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0040] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0041] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0042] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress，1989andThirdedition，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLS INMOLECULARBIOLOGY,Johnffiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates； theseriesMETHODSINENZYMOLOGY,