0~14 ho
[0020]优选地，步骤S3为在电极表面滴涂封闭液，37°C孵育lh，冲洗电极表面，风干，制备得到所述免疫生物传感器。
[0021]优选地，一种上述免疫生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
51.W 0.5-5 mM FeCl3A3 [Fe (CN) 6], 0.1 M KCl 以及 I?10 mM HCl 的复合溶液溶于0.01-0.05%壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，得到稳定的暗绿色分散液；再向分散液中加入纳米金胶使其终浓度为2.5 ~25 μ M，超声分散至完全溶解，制得沉积液；
将丝网印刷电极分别在乙醇和超纯水中超声处理，再将丝网印刷电极在+0.4V电压下浸在配制好的沉积液中，沉积时间为60 -300 s ；
将电极浸在稳定液中在-0.6 V到+0.8V之间扫描循环伏安图直至图像稳定，使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜；
52.在电极表面滴涂用0.1 M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释的包被原，使其在微碱的环境下能更好地将包被原固定在电极表面，4°C孵育10~14h ；
53.滴涂封闭液以封闭电极表面非特异性位点，37°C孵育lh，用0.01M磷酸盐冲洗、风干，制备得到所述免疫生物传感器。
[0022]优选地，稳定液为含0.1 M KC1/0.1 M HCl的水溶液。
[0023]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
(I)本发明提供一种将竞争免疫反应和生物传感器相结合的免疫生物传感器，并得到该传感器组胺检测工作曲线等一系列性能表征。该免疫生物传感器具有操作简单、灵敏度高、快速方便等优势，可用于样品中组胺检测。本发明免疫生物传感器可通过检测海产食品和鱼组织中的组胺值来判断海产食品和鱼制品的新鲜度和腐败程度，适用于在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测。
[0024](2)本发明将普鲁士蓝、壳聚糖、纳米金组成复合膜用于修饰免疫生物传感器的工作电极，其电流响应比单独沉积普鲁士蓝或纳米金具有明显地稳定性，复合膜比表面积大，易于电子传递。
[0025](3)本发明通过制备沉积液，采用一步沉积电极的方式使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜，沉积步骤比传统高分子聚合物修饰电极制备步骤简便，且更容易暴露抗原结合位点。
[0026](4)本发明免疫传感器灵活可调，可根据需要通过调整包被原及抗体浓度从而得到不同的工作曲线和检测限，进行对多种浓度范围进行测试。
【附图说明】
[0027]图1为本发明免疫生物传感器检测组胺的原理示意图。
[0028]图2为本发明免疫传感器电沉积后的电化学表征图。
[0029]图3为本发明实施例1免疫传感器检测组胺的标准曲线图。
[0030]图4为本发明实施例2免疫传感器检测组胺的标准曲线图。
[0031]图5为本发明实施例3免疫传感器检测组胺的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0033]实施例1
本实施例提供一种检测组胺的可抛式一步电沉积免疫生物传感器，采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜的电极，所述电极上固定有组胺包被原。
[0034]所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝(Fe4 [Fe (CN) 6]3)的摩尔浓度比为1:1000，壳聚糖含量为0.05%。
[0035]一种上述免疫生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
S1.将0.05g壳聚糖溶于100 mL 1.0%的醋酸溶液中，室温下搅拌3h，使壳聚糖完全溶解，配制成 0.05% 壳聚糖溶液。将 0.0406 g FeCl3，0.0822g K3 [Fe (CN)6], 0.7455g KCl 以及ImL浓盐酸加入100 mL上述壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的暗绿色分散液；再将制备好的ImL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散
0.5h至完全溶解，制备得到沉积液；
将丝网印刷电极分别在乙醇和超纯水中超声处理Imin，氮气吹干，再将丝网印刷电极在+0.4V电压下浸在配制好的沉积液中，沉积时间为60 s ;
电极浸在0.1 M KC1/0.1 M HCl溶液中在-0.6 V到+0.8V之间扫描循环伏安图直至图像稳定，使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。
[0036]S2.在电极表面滴涂用0.1 M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释后浓度为10 ug/mL的包被原，使其在微碱的环境下能更好地将包被原固定在纳米膜修饰的电极表面，4°C孵育12h0
[0037]S3.滴涂5%脱脂奶粉以封闭电极表面非特异性位点，37°C孵育lh，用0.01 M磷酸盐冲洗、风干，制备得到所述免疫生物传感器。
[0038]制备得到的免疫生物传感器检测组胺的原理示意图见图1，电沉积后该免疫传感器的电化学表征图见图2。
[0039]进一步地，分别配制浓度为0.001，0.01, 0.1, I, 10, 100 ng/mL的组胺标准液，按照上述制备方法进行循环伏安扫描，得到该免疫传感器线性检测范围为0.085-0.95ng/mL (IC20-1C80)及检测限为 0.042 ng/mL (IC10)，R2=0.993，见图 3。
[0040]实施例2
本实施例提供一种检测组胺的可抛式一步电沉积免疫生物传感器，采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜的电极，所述电极上固定有组胺包被原。
[0041]所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝(Fe4[Fe (CN)6]3)的摩尔浓度比为1:2000，壳聚糖含量为0.05%。
[0042]一种上述免疫生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
S1.将0.05 g壳聚糖溶于100 mL 1.0%的醋酸溶液中，室温下搅拌3 h，使壳聚糖完全溶解，配制成 0.05% 壳聚糖溶液。将 0.0813 g FeCl3,0.1644 g K3 [Fe (CN)6], 0.7455g KCl以及I mL浓盐酸加入100 mL上述壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的暗绿色分散液；再将制备好的I mL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散0.5 h至完全溶解，制备得到沉积液；
将丝网印刷电极分别在乙醇和超纯水中超声处理lmin，氮气吹干，再将丝网印刷电极在+0.4V电压下浸在配制好的沉积液中，沉积时间为120 s ;
电极浸在0.1 M KC1/0.1 M HCl溶液中在-0.6 V到+0.8V之间扫描循环伏安图直至图像稳定，使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。
[0043]S2.在电极表面滴涂用0.1 M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释后浓度为5 ug/mL的包被原，使其在微碱的环境下能更好地将包被原固定在纳米膜修饰的电极表面，4°C孵育10h0
[0044]S3.滴涂5%脱脂奶粉以封闭电极表面非特异性位点，37°C孵育I h，用0.01 M磷酸盐冲洗、风干，制备得到所述免疫生物传感器。
[0045]进一步地，分别配制浓度为0.001，0.01, 0.1, I, 10，100 ng/mL的组胺标准液，按照上述制备方法进行循环伏安扫描，得到该免疫传感器检测范围为0.037-0.404 ng/mL(IC20~IC80)及检测限为 0.0094 ng/mL (IC10)，R2=0.998，见图 4。
[0046]实施例3
本实施例提供一种检测组胺的可抛式一步电沉积免疫生物传感器，采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜